تشخیص سریع باکتری عامل حصبه به روش Multiplex PCR بر اساس ژنهای tyv, invA, prt، تعیین ردیف و مقایسه سکانس سویه جدا شده از ایران با بانک ژن

● هدف:
تشخیص سریع مولکولی باکتری سالمونلاتیفی عامل بیماری حصبه
● روش بررسی:
برای راه اندازی روش تشخیص سریع و اختصاصی عامل حصبه از روش PCR سریع استفاده شد. پرایمرهای اختصاصی توالی ژنهای prt, tyv, invA واقع در کروموزوم سالمونلاتیفی انتخاب گردید. DNA ژنومی از سویه های مختلف استاندارد سالمونلا و انواع ایزوله های بالینی استخراج و با استفاده از مخلوطی از پرایمرهای ذکر شده جهت تشخیص دقیق و سریع مورد بررسی قرار گرفت. جهت بررسی ویژگیهای این باکتری، از سایر باکتری های خانواده انتروباکتریاسه و همچنین کوکسی های گرم مثبت استفاده شد. جهت بررسی حساسیت از دو روش شمارش کلنی و رقت ژنوم استفاده شد. جهت افزایش دقت و سرعت آزمایش و کاهش زمان تشخیص، بهینه سازی های مختلفی در برنامه و شرایط واکنش صورت گرفت.
● یافته ها:
بررسی این روش در سویه های استاندارد و بالینی مشخص نمود که پرایمرها اختصاصی است و محصولات با اندازه مورد نظر تولید گردید. این پرایمرها با هیچکدام از انتروباکتریاسه ها، سایر سالمونلاها و همچنین کوکسی های گرم مثبت محصولی را ایجاد نکرد. روش Uniplex PCR سالمونلا را از سایر باکتریها و روش Multiplex PCR سالمونلا تیفی را از سایر سالمونلاها تفکیک می نماید. بررسی حساسیت این روش با شمارش کلنی و همچنین رقت ژنوم نشان داد که این روش قادر است ۱ تا ۱۰ کپی ژنوم و یا ۱۰-۱ واحد کلنی (CFU) باکتری سالمونلا تیفی را بطور اختصاصی تشخیص دهد. با کوتاه نمودن مراحل آزمایش در دستگاههای متداول چرخه حرارتی مدت فرایند PCR به ۳۲ دقیقه کاهش یافت و کل زمان مورد نیاز تشخیص تا کسب پاسخ نهایی کمتراز ۹۰ دقیقه می باشد. برای تایید صحت محصولات ایجاد شده در PCR این قطعات تعیین ترادف (Sequencing) گردیدند. مقایسه توالی های حاصل از سویه جدا شده از بیمار ایرانی با بانک ژن مشخص نمود که ترادف قطعات مربوط به ژنهای prt و tyv ۱۰۰ درصد با ژنهای مرجع شباهت دارند و ترادف مربوط به ژن invA سویه ایران با سه نوکلئوتید تفاوت با سویه مرجع واجد ۹۹ درصد مشابه می باشد. یافته دیگر این بود که با استفاده از پرایمر S۳-S۴ می توان سالمونلا انفانتیس و هاوانا را نیز از یکدیگر تفکیک نمود.
● نتیجه گیری:
بر اساس نتایج این تحقیق، روش مولتی پلکس PCR واحدی جهت تشخیص سریع و تفکیک سالمونلاتیفی از سایر انتروباکتریاسه ها و همچنین تفکیک از سایر باکتری های خانواده سالمونلاها حاصل گردید که می تواند جهت تشخیص سریع این عامل در نمونه های مختلف مورد استفاده قرار گیرد.
سکانس های محصولات PCR با شماره های AY۷۷۱۳۶۳, AY۷۷۱۳۶۲, AY۷۷۱۳۶۴ در بانک ژن جهانی ثبت گردیده است.

علی کرمی
زینب احمدی
زهرا سفیری

منبع : پایگاه اطلاعات علمی