مطالعات سیتوژنتیک

یكی از دقیقترین روشهای شناسایی نمونه ها در بسیاری ازگونه ها استفاده از تكنیكهای سیتوژنتیك است و مطالعات ژنوتیپی از اصیل ترین مطالعات محسوب می شود چرا كه آنچه در ظاهر نمونه بروز می كند (فنوتیپ) انعكاسی از ساختار ژنتیكی (ژنوتیپ) آن است ، هر چند در طی طریق از ژنوتیپ به فنوتیپ عوامل واسطه و تاثیر گذار متعددی همچون تاثیرات محیطی نقش آفرینی می كنند و سبب تغییراتی سوای آنچه از فنوتیپ انتظار می رفت می گردند. بنابراین حذف عوامل واسطه و رسیدن به سر منشأ آنچه سبب تغییرات ذاتی در نمونه ها می شود از اصالت خاصی برخوردار بوده و در مطالعات بنیادین توصیه می شود. تهیه كاریوتایپ و مطالعات كاریولوژیكی همانند شمارش تعداد ، شكل و اندازه كروموزومها روشنگر تفاوتهای اصیل در نمونه ها است ، هر چند اندازه كروموزومها از اهمیت كمتری برخوردار بوده ولی نسبت بازوهای كروموزومی می تواند جایگزین آن شود.
در این طرح پژوهشی ، مطالعات سیتوژنیتیكی بر روی سوسماران مشهد صورت گرفته و كاریوتایپ آنها تعیین شده است. بدین لحاظ اكثر نمونه های صید شده مورد مطالعه سیتوژنتیكی قرار گرفتند بطوریكه در گونه های Trapelus و Eremias كاریوتایپ بیش ار ۹۰% نمونه ها و در گونه های Laudakia و Mabuya كاریوتایپ بیش از ۶۰% نمونه ها تهیه گردید. جهت تهیه كاریوتایپ ضرورت داشت نمونه ها بصورت زنده به آزمایشگاه منتقل و تا هنگام كار زنده می ماندند. متابولیسم پائین خزندگان نسبت به رده های عالیتر همچون پستانداران از موانع جدی تهیه كاریوتایپهای مناسب بود و در اسارت نگهداشتن نمونه ها و عدم تغذیه آنها در طی دوره نگهداری در آزمایشگاه متابولیسم راباز هم پائین تر آورده و مشكلات كاری را مضاعف می نمود. مخمر آبجو از تركیباتی است كه تقسیمات سلولی را افزایش می دهد. بدین لحاظ بمنظور تسریع در روند تقسیم سلولی ۱۲ تا ۲۴ ساعت قبل از انجام كار به نمونه مخمر آبجو تزریق گردید. تزریق بصورت داخل سلومی و با سرنگ انسولین انجام گرفت. میزان تزریق مناسب بر اساس وزن جانور تعیین و به ازاء هر گرم وزن جانور ۲% مخمر آبجو تزریق گردید. در طی ۱۲ تا ۲۴ ساعت مخمر آبجو اثر خود را گذاشته و باعث افزایش تعداد سلولهای درحال تقسیم می گردد. مرحله بعدی ایجاد اختلال در مراحل تقسیم سلولی است . بهترین زمان در چرخه تقسیم سلولی برای مطالعه كروموزومها مرحله متافاز تقسیم میتوز است بنابراین اگر تقسیمات سلولی در این مرحله متوقف شود كروموزومها به فرم كاملاً متراكم و مشخص در آمده اند. كلشی سین یا سولفات وین بلاستین از تركیباتی است كه تقسیم میتوز را در مرحله متافاز متوقف می كند. بنابراین از این تركیبات استفاده گردید. تزریق كلشی سین نیز بصورت داخل سلومی با سرنگ انسولین انجام گرفت و میزان آن بر اساس وزن جانور تعیین گردید. بهترین میزان تزریق ۱% به ازاء هر گرم وزن جانور است. زمان تاثیر گذاری كلشی سین ۱ تا ۵/۱ ساعت است. پس از این مرحله نوبت استخراج سلولهای مناسب است. از سلولهای مختلفی میتوان جهت تهیه كاریوتایپ استفاده كرد. در انسان از سلولهای خونی بویژه لنفوسیتها استفاده می گردد ولی در جانوران خرد جثه بیشتر از مغز استخوان استفاده می شود كه مركز خون سازی است . در تهیه كاریوتایپ سوسماران نیز از مغز استخوان استفاده شد لذا پس از بیهوش كردن نمونه با كلروفورم ، جانور تشریح و یكی ازاستخوانهای ران آن از پا جدا می شد.
جداسازی استخوان ران بنحوی انجام می گرفت كه حداقل آسیب را به آناتومی جانور وارد سازد بنابراین استخوان از لابلای عضلات خارج و آنگاه از محل اتصال باكمر بند لگنی آزاد و جدا می شد. عضلات و سایر قسمتهای اندام حركتی به تنه متصل مانده و سپس جهت نگهداری دائمی نمونه ها دربخشهای مختلف جانور فیكساتور فرمالین ۶% تزریق میگردید. این تزریق از درون دهان و كلواك جهت تثبیت دستگاه گوارش ، از ناحیه شكمی جهت تثبیت اندامهای داخلی ، درون دستها و پاها و دم جهت تثبیت عضلات و... انجام می گرفت و نمونه ها پس از فرم گیری با دستگاه دایموند شماره گذاری و به جمع نمونه های كلكسیون سوسماران موزه جانور شناسی دانشكده علوم دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد افزوده می گشت.
پس از جداسازی ران ، طرفین استخوان برش خورده و محتویات آن استخراج می گردید كه مملو از سلولهای خونی ساخته شده در مغز استخوان بود. مرحله بعدی نازك كردن غشاء این سلولها بود تا عمل آزادسازی ژنوم سلول راحت تر انجام گیرد. این فرایند بكمك محلول KCl انجام پذیرفت. بدین لحاظ سلولهای جداشده از مغز استخوان در محلول KCl قرار گرفته و بمدت چند دقیقه در انكوباتور با دمای حدود ۳۵ نگهداری می شد. سپس جهت خالص سازی سلولهای مورد نیاز از سایر عوامل از جمله چربیها و... محلول سانتریفوژ می گردید. این عمل طی ۳ مرحله بمدت ۱۰ دقیقه و با سرعت ۱۰۰۰ دور در دقیقه انجام می گرفت. در هر مرحله به رسوب ایجاد شده از سانتریفوژ مقداری محلول فیكساتور كه تركیبی از متانول و اسید استیك گلاسیال به میزان ۳ به ۱ بود افزوده و عمل سانتریفوژ تكرار می گردید و محلول رویی لوله سانتریفوژ دور ریخته می شد. در آخرین مرحله سانتریفوژ به رسوب باقیمانده حدود ۵/۰ فیكساتور افزوده شده و پس از همگن كردن رسوب ، محلول حاصله را از ارتفاع حدود ۵۰ سانتیمتری بر روی لام میكروسكوپی پرتاب می كردیم. هدف از این كار پاره شدن غشاء نازك شده و آزاد سازی كروموزومها و پخش شدن آنها بر روی لام بود. آنگاه محتویات روی لام توسط شعله ملایم ثابت و نهایتاً توسط گیمسای ۱۵% رنگ آمیزی می گردید. مرحله آخر پیدا كردن كاریوتایپ مناسب بر روی لام ، عكسبرداری از آن و نهایتاً مطالعه و تكمیل جدول آنالیز كروموزومی نمونه ها بود كه در ادامه مورد بحث قرار می گیرد.
شمارش كروموزومها ، تعیین وضعیت آنها از نظر محل استقرار سانترومر ، اندازه گیری طول آنها و یافتن همولوگها و... از كارهای مرسوم در مطالعات كاریولوژیكی است.
شمارش كروموزومهای نمونه ها بر اساس عكسهای تهیه شده از كاریوتایپ آنها انجام و عدد كروموزومی آنها بدست می آمد. در رابطه با محل استقرار سانترومر ، كروموزومها را میتوان به چهار گروه متاسانتریك ، ساب متاسانتریك ، ساب تلوسانتریك و تلوسانتریك (اكروسانتریك) تقسیم كرد . معیار این تقسیم بندی نسبت بازوهای بزرگ و كوچك كروموزومها به یكدیگر میباشد.
تشخیص و تعیین كروموزومهای همولوگ بر اساس اندازه كلی كروموزوم و نوع آن انجام می گیرد و سایر نتیجه گیریها بر اساس ترسیم ایدیوگرام مربوطه قابل حصول است . ایدیوگرام در حقیقت ترسیمی الهام گرفته از كاریوتایپ حقیقی است با این تفاوت كه در آن اصلاحاتی (همچون رفع كج شدگیهای كروموزومها) انجام شده است . این ترسیم از جهات بسیاری مطالعه را دقیق تر و راحت تر می نماید. ایدیوگرامها طوری ترسیم شده اند تا مواردی همچون طول بازوهای كروموزومی و درصد طول هر كروموزوم نسبت به طول كل كروموزوم ها قابل تشخیص باشد.

شناسایی فون و كاریوتایپ سوسماران مشهد : آقای دكتر علی نعمتی
( دكترای فزیولوژی جانوری ، عضو هیئت علمی دانشگاه آزاد اسلامی مشهد )

منبع : blogfa