واکنش‌ زنجیره‌ پلی‌مراز PCR

‌‌‌‌مسئله‌ اصلی‌ در بررسی‌ یک‌ ژن‌ خاص‌ مشکل‌ هدف‌ گیری‌ آن‌ در یک‌ ژنوم‌ پیچیده‌ که‌ ممکن است‌ بیش‌ از صد هزار ژن‌ داشته‌ باشد است. بسیاری‌ از روشها در ژنتیک‌ ملکولی‌ به‌ این‌ مشکل‌ فائق‌آمده‌اند. تکنیکPCR ‌در اواسط‌ دههِ ۱۹۸۰ در دپارتمان‌ ژنتیک‌ انسانی‌ بوسیلهِKaru Mullis ابداع‌و برای‌ تکثیر ژن‌ کم‌ خونی‌ داسی‌ شکل‌ و بتاگلوبین‌ انسانی‌ مورد استفاده‌ قرار گرفتSaiki(۱۹۸۵) از پژوهشگران‌ شرکت‌ مهندسی‌ ستوساشکالات‌ موجود را رفع‌ کرد وروش متداول‌ کنونی‌ را ابداع‌ نمود.
حقوق‌ تجاری‌ این‌ اختراع‌ اینک‌ به‌ شرکت‌ هافمن‌ - روچت تعلق‌ داردKaru Mullis در سال‌ ۱۹۹۳ موفق‌ به‌ کسب‌ جایزهِ نوبل‌ شیمی‌ گردید. واکنش‌ زنجیرهِ پلی‌ مراز یک‌روش‌ آزمایشگاهی‌ است‌ که‌ به‌ منظور تولید انبوه‌ قطعه‌ خاص‌ و انتخابی‌ ازDNA به‌ کار می‌رود.‌‌‌واکنش‌ مبتنی‌ بر تکثیر آنزیمی‌ قطعه‌ای‌ ازDNA است‌ که‌ با استفاد از دو آغازگر چند نوکلئوتیدی‌ که‌ مکمل‌ پایانهِ َ۵ هر دو رشته‌ مورد نظر هستند، صورت‌ می‌گیرد تا کپی‌ شدن‌ الگوی‌DNA توسط‌ آنزیم‌ پلیمراز امکان‌پذیر شود در سال‌ ۱۹۸۵ تنها سه‌ مقاله‌ علمی‌ در زمینهPCR ‌گزارش‌ شده‌ بود. پنج‌ سال‌ بعد از آن‌ این‌ روش‌ در هزاران‌ آزمایشگاه‌ استفاده‌ گردید و تاکنون‌ هزاران‌مقاله‌ و دهها کتاب‌ مستقل‌ به‌ این‌ موضوع‌ اختصاص‌ داده‌ شده‌ است‌ به‌ گونه‌ای‌ که‌ دانشگاه‌ آکسفوردحتی‌ مجله‌ای‌ به‌ نامPCR ‌ منتشر می‌سازد .
‌‌‌‌به‌ عقیده‌ بیولوژیستهاPCRوسیله‌ای‌ است‌ که‌ سوزنی‌ را در کوهی‌ از کاه‌ پیدا می‌کند.PCR از نظر اصولی‌ عملی‌ تشابه‌ زیادی‌ به‌ همانند سازیDNA ‌ دارد و در واقع‌ برگرفته‌ از آن‌ است‌بطورکلی‌ دو فرق‌ بینPCR ‌ و همانندسازی‌ وجود دارد: همانند سازی‌ در بدن‌ در دمایc ‌۳۷با آنزیم‌DNA پلی‌ مراز و آنزیمهای‌ دیگر صورت‌ می‌گیرد درPCRبه‌ علت‌ نیاز به‌ درجه‌ حرارت‌ بالا جهت‌واسرشت‌ شدن‌ از آنزیم‌ مقاوم‌ به‌ حرارت‌ همانندTaqاستفاده‌ می‌شود و به‌ جای‌ سایر آنزیمها ازتغییرات‌ درجه‌ حرارت‌ استفاده‌ می‌شود.
● مقایسه‌ تکثیر ژن‌ از طریق‌ کلونینگ‌ باPCR
▪ در کلونینگ‌ هفته‌ها یا ماهها وقت‌ برای‌ تکثیر قطعهDNA ‌ لازم‌ است، در حالیکه‌ درPCR قطعات‌ خاصDNA از ژنومی‌ پیچیده، ظرف‌ چند ساعت‌ بدست‌ می‌آید.
▪ درPCRمقادیر بسیار کمی‌ ازDNAبرای‌ تکثیر موردنیاز است‌ درحالیکه‌ در روشهای استاندارد کلونینگ‌ وتجزیه‌ وتحلیلهای‌ بیولوژی‌ ملکولی‌ به‌ چند میلیون‌ قطعه‌ ازDNAاحتیاج‌ است.
‌‌‌‌▪ برای‌ کلون‌ کردن،DNAتا حد امکان‌ باید خالص‌ باشد ولی‌ برایPCR ‌ خلوصDNAاهمیت‌ زیادی‌ ندارد
‌‌‌‌▪ تکثیرDNAدرPCRدر محیط‌ عاری‌ از سلول‌ صورت‌ می‌گیرد ولی‌ کلونینگ‌ به‌ سلولهای زنده‌ نیاز دارد.
‌‌‌‌▪ یکی‌ از مزایایPCR ‌ سرعت‌ آن‌ است‌ پلیمرازTaqمی‌تواند توالی‌هایی‌ متجاوز از هزارجفت‌ باز را در ظرف‌ مدت‌ کمتر از یک‌ دقیقه‌ تکثیر نماید.
‌‌‌▪ درPCRنیازی‌ به‌ جدا کردن‌ قطعه‌ مورد نظر از محل‌ استقرارش‌ در DNAنمی‌باشدحالیکه‌ این‌ محدودیت‌ در روشهای‌ کلونینگ‌ وجود دارد.
● اصول‌ و مبانیPCR ‌
‌‌‌‌واکنش‌ زنجیره‌ پلی‌مراز مبتنی‌ بر تکثیر آنزیمی‌ قطعه‌ای‌ ازDNA است‌ که‌ با استفاده‌ ازآغازگر صورت‌ می‌گیرد. طول‌ آغازگر بایستی‌ به‌ اندازهِ کافی‌ بزرگ‌ باشد تا توالیهای‌ مشابه‌ به‌ آنها درنواحی‌ غیر هدف‌ یافت‌ نگردد پرایمرها دو عمل‌ را انجام‌ می‌دهند.اندازه‌ قطعات‌ تکثیر شونده‌ را مشخص‌ می‌کنند،محل ‌ ژنی‌ که‌ باید تکثیر شود را مشخص‌ می‌کنند.‌‌‌‌بعد از اتصال‌ آغازگر به‌ مکملهای‌ خود در توالی‌ هدف، انتهای‌ هیدروکسیل‌ َ۳ آنها رو به‌ سوی ناحیه‌ هدف‌ قرار می‌گیرد.
PCR‌‌‌‌ طی‌ سه‌ دورهِ متوالی‌ واسرشت‌ سازیرشتهِ الگو، اتصال‌ آغازگر و بسط توسط آنزیم‌ پلی‌مراز انجام‌ می‌گیرد.
‌‌‌‌در چرخه‌ اول‌ و دوم‌ فرآوردهِ حاصل‌ از بسط‌ دارای‌ طول‌ مشخصی‌ نیست. در چرخه‌ سوم قطعاتی‌ ساخته‌ می‌شود که‌ طول‌ آنها مشخص‌ است‌ از چرخهِ چهارم‌ تکثیر به‌ صورت‌ نمائی‌ است‌
● پارامترهای‌ سیکلی‌
‌‌‌‌روشPCR ‌ بطوردستی‌ (بوسیله‌ حمام‌ آبی) و هم‌ بطور اتوماتیک‌ و با ترموسایکلر صورت می‌گیرد. ابتدا با حرارت‌ ۹۰-۹۴(در۳۰ ثانیه) دو رشتهDNA ‌ از یکدیگر جدا می‌شود و سپس‌ بامختصری‌ برودتc ‌۳۰-۶۵بمدت‌ (۳۰ثانیه) پرایمرها به‌ مکملهای‌ خود درروی‌ رشتهDNA ‌ متصل‌می‌شوند وبه‌ دنبال‌ آن‌ با رساندن‌ دما به‌ ۵۷-۷۰(۵-۲ دقیقه) شرایط‌ برای‌ گسترش‌ پرایمرهای‌چسبیده‌ بوسیلهِ آنزیم‌ تک‌ پلی‌مراز فراهم‌ می‌شود.زمان‌ شیب‌ حرارتی‌ یا زمانی‌ که‌ درجه‌حرارت‌ از مقداری‌ به‌ مقدار دیگر عوض‌ می‌شود بستگی‌ به‌ نوع‌ دستگاه‌ به‌ کار برده‌ شده‌ دارد برای‌اطمینان‌ از اینکه‌ نمونه‌ها به‌ درجه‌ حرارت‌ مورد نظر رسیده‌اند مدت‌ زمان‌ پرش‌ حرارتی‌ بوسیلهِاندازه‌گیری‌ ترمومتر نمونه‌ درطی‌ یک‌ آزمایش‌ تکثیرانجام‌ می‌شود .گرمای‌ غیرکافی‌ درطی‌مرحله‌ واسرشت‌ یکی‌ ازعلتهائی‌ است‌ که‌ باعث‌ شکست‌ در واکنشPCR ‌ می‌گردد
● استخراجDNA ‌ برایPCR ‌
‌‌‌‌نقطهِ شروع‌ بسیاری‌ از روشهای‌ بیولوژی‌ مولکولی‌ ضرورت‌ جداسازیDNAبا کیفیت‌ عالی است. معمولا کیفیتDNA ‌ با عواملی‌ از قبیل‌ عدم‌ آلودگی‌ ناشی‌ ازRNA، پروتئین، لیپید و سایرساختارهائی‌ که‌ برای‌ آنزیمهای‌ برشی‌ و پلی‌ مرازها مزاحمت‌ ایجاد می‌کنند سنجیده‌ می‌شود. به‌علت‌ بزرگ‌ بودن‌ اندازهِDNAومی‌ در پستانداران، روشهای‌ استخراجDNA ‌ باید حداقل‌ استرس‌مکانیکی‌ را در طی‌ استخراج‌ ایجاد نمایند.‌‌‌‌معمولإ روشهائی‌ که‌ در آنها چندین‌ شوینده‌ همچونSDS ‌ وtritonX۱۰۰ استفاده‌ می‌شود.
که‌ نقش‌ آنها لیز نمودن‌ سلول‌ و کمک‌ به‌ از بین‌ بردن‌ پروتئین‌ متصل‌ بهDNA ‌ می‌باشد. پروتئین‌زدائی‌بیشتر از طریق‌ پروتیئنازK صورت‌ می‌گیرد که‌ این‌ ماده‌ در بافر لیز کننده‌ مورد استفاده‌ قرار می‌گیرد.این‌ آنزیم‌ در حضورSDSدر دمایc ‌۵۶-۶۵ فعالیت‌ دارد تحت‌ این‌ شرایط‌ پروتئین‌ بهتر واسرشت‌می‌شود برعکس‌ در همین‌ شرایط‌ آنزیمهای‌ دیگر مثلDNAase ‌ دناتوره‌ می‌شود.‌‌‌‌متعاقب‌ استفاده‌ از پروتیئنازKاز ایزوپروپانول‌ برای‌ از بین‌ بردن‌ موِثر پروتئین‌ها استفاده می‌شود و باقیمانده‌ پروتئین‌ و لیپید نیز بطور موِثر از طریق‌ کاربرد فنل‌ و کلروفورم‌ از بین‌ می‌رودآلودگیRNA ‌ از طریق‌ تیمار کردن‌ نمونه‌ با RNAase از بین‌ می‌رود.‌‌‌‌در روشهای‌ دیگر بعد از پروتئینازK از نمک‌ اشباع‌ برای‌ رفع‌ آلودگی‌ پروتئین‌ استفاده‌ می‌شود در استخراجDNA ‌ از هپارین‌ برایPCR ‌ بهتر است‌ استفاده‌ نشود چون‌ هپارین‌ از فعالیتTaq ‌ پلی‌مراز جلوگیری‌ می‌کند .‌‌‌‌وجودEDTAحداقلmM ‌۲در بافر استخراج‌ باعث‌ می‌شود که‌ کوانزیمهای‌ آنزیمAase ‌ DN‌باEDTAشلات‌ شود و از تجزیه‌ تصادفیDNA‌جلوگیری‌ نماید.
● تعداد سیکلPCR ‌:
‌‌‌‌بعضی‌ از راهنمایی‌ها برای‌ تعداد سیکلها در مقابل‌ غلظت‌ الگوی‌ آغازی‌ چنین‌ پیشنهاد شدهاست.
● طراحی‌ آغازگر:
‌‌‌‌قواعد مشخصی‌ برای‌ اینکه‌ بتوان‌ با اطمینان‌ یک‌ جفت‌ پرایمر موِثر را انتخاب‌ کرد وجودندارد. در حال‌ حاضر پرایمر بیش‌ از هر عامل‌ دیگری‌ عامل‌ موفقیت‌ یا شکست‌ در یک‌ واکنش‌تکثیری‌ است. بعضی‌ قواعد راهنمایی‌های‌ مفیدی‌ را در مورد طراحی‌ آغازگر می‌کنند که‌ ذیلاإ به‌ آنهااشاره‌ شده‌ است.
▪ طول‌ متوسط‌ هر پرایمر بین‌ ۱۸- ۳۰جفت‌ باز پرایمر با طول‌ کوچک‌ اتصال‌ غیراختصاصی‌ را افزایش‌ و پرایمر بزرگتر سرعت‌ هیبریداسیون‌ را کم‌ می‌کند
مقدارG-C دو پرایمر با هم‌ مشابه‌ بوده‌ و حدود ۵۰-۶۰ درصد باشد.
▪ آغازگرها را باید از نظر مکمل‌ بودن‌ با هم‌ کنترل‌ شوند.
‌‌‌‌پرایمر دایمر یا آغازگر دوتائی‌ یک‌ تکثیر مصنوعی‌ است‌ که‌ اغلب‌ در محصولPCR ‌ مشاهده می‌شود و عبارتست‌ از یک‌ قطعهِ دو رشته‌ای‌ که‌ طول‌ آن‌ تقریبا به‌ مجموع‌ دو پرایمر نزدیک‌ است‌ وهنگامی‌ مشاهده‌ می‌شود که‌ یک‌ پرایمر توسط‌ آنزیم‌ پلیمراز به‌ روی‌ پرایمر دیگر گسترش‌ یابدمکانیزم‌ واقعی‌ که‌ چگونه‌ پرایمر دایمر تشکیل‌ می‌شود بدرستی‌ مشخص‌ نیست. پرایمرها با انتهای‌مکمل‌ َ۳ مستعد تشکیل‌ دایمر هستند. ضعف‌ در آنزیمTaq ‌ باعث‌ پلیمریزاسیون‌ مستقیم‌ الگوی‌غیرهدف‌ شود. در هر حال‌ چنانچه‌ پرایمر دایمر بعنوان‌ مانعی‌ مشاهده‌ شوند می‌توان‌ آن‌ را تاحدودی‌ با غلظت‌ حداقل‌ پرایمر و آنزیم‌ کاهش‌ داد.
▪ در انتهای‌ َ۳ پرایمر باید حداقلC ‌ یاGقرار گیرد در توالی‌هائی‌ پرایمرهائی‌ که‌ انتهای‌ َ۳ آنها غنی‌ا زG+C می‌باشد احتمال‌ اتصال‌ اشتباهی‌ افزایش‌ می‌یابد
▪ باید تا حد امکان‌ از توالیهای‌ پالیندرومیک‌ داخل‌ پرایمرها جلوگیری‌ کرد.
▪ نسبت‌ چهار نوکلئوتید در آغازگر حتی‌المقدور یکسان‌ باشد.
▪ آغازگر به‌ توالی‌ تکرار شونده‌ ختم‌ نشود.
▪ دمایTm ‌ دو آغازگر نزدیک‌ هم‌ باشد .
▪ حدمجاز دمای‌ اتصال‌ پرایمر طراحی‌ شده‌باید بین‌ ۶۵-۵۵ باشد. دمای‌ تکثیرایده‌آل‌ ۶۲-۷۲می‌باشد.
‌‌‌‌درجه‌ حرارتی‌ که‌ پرایمر بهDNA ‌ الگو متصل‌ می‌شود به‌ طول‌ آغازگر و مقدارGC آن‌ بستگی دارد برای‌ پرایمرهای‌ حاوی GC ‌۵۰% و دارای‌ ۲۰ نوکلئوتید، دمای‌ ۵۵ درجه‌سانتیگراد پیشنهادمی‌شود برای‌ افزایش‌ اختصاصی‌ عمل‌ کردن‌ آغازگر حتی‌ ممکن‌ است‌ دماهای‌ بالاتری‌ هم‌ موردنیازباشد.
‌‌‌‌برای‌ اینکه‌ هر پرایمر با رشته‌ الگوی‌ خودش‌ هیبرید شود لازم‌ نیست‌ که‌ عینا و کاملا مکمل رشتهِ الگو باشد برای‌ طراحی‌ پرایمر اغلب‌ از برنامه‌های‌ کامپیوتری‌ ویژه‌ استفاده‌ می‌شود فاصله‌ بین‌پرایمرهایی‌ که‌ باDNAی‌ هدف‌ هیبرید می‌شود بطور معمول‌ کمتر از ۱۵ کیلو باز می‌باشد.‌‌‌‌در حقیقت‌ یک‌ کاهش‌ اساسی‌ در سنتز موِثر هنگامی‌ که‌ محصول‌ تکثیر متجاوز ا زb ۱۰۰۰می‌شود، مشاهده‌ می‌گردد. به‌ همین‌ دلیل‌ طول‌ قطعه‌ مورد تکثیر درPCRنباید بیش‌ ازKb۳ باشد وحدمطلوب‌ کمتر ازKb۱می‌باشد ‌‌‌‌تکثیر قطعات‌ بسیار طویل‌ و بالایKb ‌۴۰ مقدور است‌ اما نیاز به‌ روشهای‌ ویژه‌ای‌ دارد.
● دمای‌ ذوب‌ آغازگر
‌‌‌‌دمای‌ اتصال‌ باید بقدر کافی‌ پایین‌ باشد تا پرایمر وDNA الگو قادر به‌ اتصال‌ باشند و از سوی دیگر باید به‌ قدر مناسب‌ بالا باشد تا از تشکیل‌ اتصالات‌ غیراختصاصی‌ جلوگیری‌ کند. دمای‌ اتصال‌از روی‌ شاخصی‌ به‌ نام‌ درجه‌ حرارت‌ ذوب‌ محاسبه‌ می‌شود. دمای‌ ذوب‌ درجه‌ حرارتی‌ است‌ که‌ درآن‌ نیمی‌ از DNAبه‌ صورت‌ تک‌ رشته‌ای‌ درآمده‌ است. یکی‌ از مهمترین‌ مشخصاتTm ‌وابستگی‌ آن‌ به‌ ترکیب‌ بازیDNA ‌ استG. وC سه‌ پیوند هیدروژنی‌ و بازهای‌ آدنین‌ و تیمین‌ دوپیوند هیدروژنی‌ دارند. بنابراین‌ هر چقدر مقدار گوانین‌ و سیتوزین‌ درDNAبیشتر باشدTmبیشتراست. دمای‌ ۲-۱ درجه‌ سانتیگراد کمتر ازTmکافیست‌ که‌ هیبریداسیون‌ بین‌ پرایمر وDNAی‌ الگودر آن‌ صورت‌ گیرد. دمای‌ ذوب‌ بطور معمول‌ از طریق‌ فرمول‌ سادهِ زیر نیز محاسبه‌ می‌شود.
c ‌‌۰Tm = ]۴ * (G + C) + ۲ * (A + T) برای‌ هر پرایمر ۲۰ نوکلئوتیدی‌
دو پرایمر باید طوری‌ طراحی‌ شوند که‌ دارایTm ‌ یکسان‌ باشند در غیر اینصورت‌ درحرارت‌ مناسب‌ برای‌ یک‌ پرایمر برای‌ جفت‌ دیگر نامناسب‌ خواهد بود.‌‌‌‌بسیاری‌ از آزمایشگاهها دمای‌ چسبیدن‌ را از ۵-۳ درجه‌ سانتیگراد زیر دمای‌ ذوب(Tm) ‌ که‌ طریق‌ این‌ فرمول‌ محاسبه‌ شده‌است‌ درنظر می‌گیرند. از این‌ موضوع‌ نتیجه‌ گرفته‌ می‌شود که‌پرایمرهای‌ با طول‌ زیاد باعث‌ افزایش‌ بالا رفتن‌ اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ نمی‌شود.
بعضی‌ از محققین‌ رابطه‌ زیر را برای‌ محاسبهTm ‌ پرایمر بکار می‌برند.
(FA)‌‌ ۳۶/۰/L) - ۰۰۵(G + C) - ( ۱۱۴/۰ ]j+[ + ۰۱Log)۶/۶۱ + ۵/۱۸Tm =
Kcl‌‌ غلظت‌ کاتیون‌ منو و لنتj=
‌‌طول‌ الیگو نوکلئوتیدL=
‌‌فرمامید که‌ یک‌ افزایندهِPCRاستFA =‌
‌‌‌‌بطور معمولPCR ‌ در غیاب‌ فرمامید انجام‌ می‌شود بنابراین‌ می‌توان‌ آن‌ را از آخر فرمول حذف‌ کرد. این‌ فرمول‌ برای‌ پرایمرهای‌ ۰۷-۴۱ بازی‌ مناسب‌ است.‌‌‌‌فرمول‌ دیگر برای‌ محاسبهTm ‌ پرایمر برای‌ نوکلئوتیدهایbp ‌۲۰-۳۵ مناسب‌ می‌باشدبصورت‌ زیر است.
(Ln)‌‌ ۶۴/۱ + ۲۲Tp =
‌‌‌‌که‌ در آن( G + C ) + ( A + T ) = Ln ‌ ۲ طول‌ پرایمر وTPدمای‌ مناسب‌ اتصال‌ اس
● غلظت‌ پرایمرها و روش‌ اندازه‌گیری‌ آن‌
‌‌‌‌غلظت‌ پرایمر بین‌ ۵۰/۰ تا ۵/۰ میکرومول‌ و حد مطلوب‌ ۶/۰ - ۱/۰ برای‌ یک‌ واکنش۲۵ میکرولیتری‌ می‌باشد. غلظت‌ بالای‌ پرایمر باعث‌ بسط‌ غیراختصاصی‌ و پرایمر- دایمر می‌شود.بعضی‌ از منابع‌ روش‌ زیر را برای‌ محاسبه‌ غلظت‌ پرایمر پیشنهاد کرده‌اند‌‌‌‌برای‌ انجام‌ این‌ محاسبه‌ ابتدا لازمست‌ که‌ ضریب‌ تکثیر مولی‌ پرایمر در ۲۶۰ نانومتر محاسبه شود که‌ غلظت‌ مولی‌ می‌تواند با استفاده‌ از فرمول‌ زیر محاسبه‌ شود.روش‌ دیگر محاسبه‌ براساسOD ‌۴می‌باشد.
● اتصال‌ پرایمر
‌‌‌‌دما و مدت‌ زمان‌ لازم‌ برای‌ اتصال‌ پرایمر به: ۱) طول‌ پرایمر، ۲) ترکیب‌ نوکلئوتید۳) غلظت‌ پرایمر بستگی‌ دارد.‌‌‌‌با توجه‌ به‌ طیف‌ فعالیت‌ آنزیمTaq ‌ پلی‌مراز که‌ در محدوده‌ ۵۸-۰۲ درجه‌ سانتیگراد می‌باشددمای‌ اتصال‌ در محدودهِ ۷۲-۵۵ درجه‌ سانتیگراد بطور معمول‌ بهترین‌ نتیجه‌ را می‌دهد افزایش‌دمای‌ اتصال‌ بسط‌ غیراختصاصی‌ را در انتهای‌ َ۳ پرایمر کاهش‌ می‌دهد. دمای‌ پایین‌ تکثیر همراه‌ باغلظت‌ اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ را کاهش‌ می‌دهد
● بسط‌ پرایمر
‌‌‌‌مدت‌ زمان‌ بسط‌ بستگی‌ به‌ عوامل: ۱) طول‌ توالی‌ هدف، ۲) غلظت‌ توالی‌ هدف‌ و ۳) دمای تکثیر دارد.‌‌‌‌بسط‌ پرایمر بطورمعمول‌ دردمای‌ ۷۲ درجه‌ سانتیگراد انجام‌ می‌شود یک‌ زمان‌ بسط‌ دقیقه‌ای‌ در ۷۲ درجه‌ سانتیگراد برای‌ فرآورده‌های‌ معادل‌ ۲ کیلو باز کافیست‌
● بافرPCR
‌‌‌‌متداولترین‌ بافرPCRکه‌ همراه‌ با تک‌ پلی‌ مراز استفاده‌ می‌شود حاوی‌ غلظت‌ ۱۰ برابرکه‌ قبل‌ از استفاده‌ باید به‌ نسبت‌ (۱۰:۱) رقیق‌ شود این‌ بافر حاوی‌ اجزای‌ زیر است.
‌‌‌‌برای‌ یک‌ واکنشPCR ‌، غلظتTris - Cl ‌،mM ۰۵-۰۱ می‌باشد KClبا غلظت‌ در حدmM۰۵را می‌توان‌ در مخلوط‌ واکنش‌ بمنظور آسان‌ شدن‌ اتصال‌ پرایمر به‌ رشته‌ الگو اضافه‌ کردNaCl با غلظتmM ‌۰۵ یاKCl با غلظت‌ بیش‌ ازmM ۵۰ اثر باز دارندگی‌ بر روی‌ فعالیت‌ آنزیم‌ تک‌ پلی‌ مرازدارند.
● غلظت‌ منیزیم‌
‌‌‌‌غلظت‌ منیزیم‌ در تکثیر اختصاصی‌ و نیز فعالیت‌ آنزیمTaq ‌ پلی‌ مراز موِثر استPCR . بایستی‌ دارای‌ ۵/۰ تا ۵/۲ میلی‌ مول‌ منیزیم‌ باشد حضورEDTAدر مقدار منیزیم‌ اشکال‌ ایجادمی‌کند غلظتMgCl۲‌ در مخلوط‌ نهائی‌ واکنش‌ می‌تواند متغیر باشد معمولاإ میزان‌ بهینه‌ آن‌ درمحدودهِ ۵-۵/۰ میلی‌ مول‌ است.‌‌‌‌یون‌ +۲Mgدو عمل‌ انجام‌ می‌دهد: اول‌ اینکه‌ باdNTPیک‌ ترکیب‌ قابل‌ حل‌ ایجاد می‌کنند،دوم‌ فعالیتTaq ‌ پلی‌ مراز را تحریک‌ می‌کند ‌‌‌‌معمولا کمبود +۲Mg باعث‌ کاهش‌ بازده‌ و زیادی‌ آن‌ باعث‌ تکثیر غیراختصاصی‌ می‌شود.
آنجائی‌ کهdNTP ‌ می‌تواند به‌ +۲Mgبچسبد، تعیین‌ دقیق‌ غلظت‌ منیزیم‌ به‌ غلظتdNTP‌بستگی‌دارد در غلظت‌ مناسب‌ منیزیم‌ و افزایشmM ‌۶-۴dNTP ،سرعت‌ سنتز تک‌ پلی‌ مراز ۳۰-۲۰ درصدکاهش‌ می‌یابد.
● دی‌اکسی‌ نوکلئوزیدتری‌ فسفاتهاdNTP))
dNTP‌‌‌‌ به‌ دو صورت‌ منفرد یا مخلوطی‌ از چهارdNTPتهیه‌ می‌شودpH . اکثر محلولهایاستوک‌ باNaOHبه‌ ۵/۷ رسانده‌ می‌شود.PCRمعمولا با غلظت‌ حدود میلی‌مول،dNTP۱۰۰ انجام‌ می‌گیرد اما غلظت‌ مناسبdNTP بستگی‌ به‌ غلظتMgCl۲‌، غلظت‌ پرایمر، طول‌ محصول‌ تکثیر شده‌ و تعداد سیکلهایPCR‌دارند. محلولهای‌ پایهdNTP‌در ۲۰- درجه‌ سانتیگراد نگهداری‌ می‌شود. و این‌ محلولهای‌ پایه‌dNTP باید تا ۷pH=خنثی‌ شود و از طریق‌ اسپکتوفتومتر تعیین‌ غلظت‌ شوند.‌‌‌‌در کارهای‌ مولکولی‌ توصیه‌ می‌شود که‌ در محلول‌ کار، از هرdNTPیک‌ میلی‌ مول‌ موجودباشد ‌‌‌‌برای‌ به‌ حداقل‌ رساندن‌ خطاها هرنوعdNTP ‌ باید درغلظت‌های‌ مساوی‌ بکاربرده‌ شوند یعنی از علل‌ بسط‌ غیراختصاصی‌ غلظت‌ کمتر از یک‌ میکرومولdNTP ‌ یا غلظت‌ کم‌ یکی‌ از بازها است‌‌‌‌ترکیب‌ دمای‌ بالا بسط‌ و اتصال‌ بالای‌ ۵۵ درجه‌ و غلظت‌ پایین‌ ۵۰-۱۰ میکرومولdNTP ‌باشد.باعث‌ بیشترین‌ دقت‌ در فرآوردهِ نهاییPCR‌ می‌شود
● آنزیمهای‌ پلی‌مراز
DNA‌‌‌‌ پلی‌ مرازها آنزیمهائی‌ هستند که‌ با استفاده‌ از منومرهای‌ دی‌اکسی‌ نوکلئوزیدتری فسفات‌ و با الگو قرار دادن‌ رشته‌ اصلی‌ ساخت‌ زنجیره‌ پلی‌ نوکلئوتیدی‌ را تسریع‌ می‌کنند. ساخت‌DNA معمولا از جهت‌ َ۵ بطرف‌ َ۳ است، زیرا پلی‌مریزاسیون‌ اغلب‌ از ۵ آلفا فسفات‌ دزکسی‌نوکلئوتید تری‌فسفات‌ بطرف‌ پایانهِ ۳ گروه‌ هیدروکسیل‌ رشتهDNA ‌ استDNA . پلی‌ مراز برخلاف‌RNA پلی‌مراز نیاز به‌ قطعهDNA ‌ کوچک‌ یا پرایمر برای‌ چسبیدن‌ به‌ توالی‌ مکمل‌ دارد DNA‌‌‌‌ پلی‌ مرازها قادر به‌ تکثیر قطعاتی‌ با حداکثر ۰۰۴ جفت‌ باز می‌باشند و در دماهای‌ بالاعلت‌ حساس‌ بودن‌ این‌ آنزیم‌ نسبت‌ به‌ دما باید مرتباإ پلیمراز جدیدی‌ اضافه‌ شود. این‌ نحوه‌ عمل‌سرعت‌ و دقت‌ عمل‌ را پایین‌ می‌آورد.
● DNA پلی‌مراز تگ‌
‌‌‌‌حسن‌ این‌ نوعDNA ‌ پلی‌ مراز درجه‌ حرارت‌ بالا (۵۹-۰۹ درجه‌ سانتیگراد) آن‌ است. علاوه بر این‌ آنزیم‌ تک‌ می‌تواند قطعاتDNA ‌ به‌ طول‌ ۱۰ هزار جفت‌ را تکثیر کند.‌‌‌‌استفاده‌ ازDNA پلیمراز مقاوم‌ به‌ حرارت‌ حاصل‌ از باکتری‌ ترموس‌ آکواتیکوس‌ که‌ منشاءچشمه‌ آب‌ گرم‌ پارک‌ ملی‌ یلواستون می‌باشد باعث‌ ساده‌ و خودکار شدن‌ واکنش‌ می‌شود. پلی‌مرازهای‌ مقاوم‌ در برابر حرارت‌ موجب‌ شده‌اند که‌ بسط‌ اختصاصی‌ فرآوردهPCR ‌ بخاطر اتصال‌ وبسط‌ آغازگر در دمای‌ بالا افزایش‌ یابد.‌‌‌‌دمای‌ مناسب‌ برای‌ فعالیت‌ این‌ آنزیم‌ با توجه‌ به‌ الگویDNA ‌، برابر ۸۰-۷۵ درجه‌ سانتیگراداست. در دمای‌ ۰۷ درجه‌ سانتیگراد بیش‌ از ۶۵ نوکلئوتید در ثانیه‌ پلی‌ مریزه‌ می‌شود.
● غلظت‌ آنزیم‌
‌‌‌‌غلظت‌ توصیه‌ شده‌ برای‌ تگ‌ پلی‌مراز بین‌ ۵/۲-۱ واحد در صد میکرو لیتر واکنش‌ توصیه شده‌ است. در صورتیکه‌ غلظت‌ آنزیم‌ بسیار بالا باشد، فرآورده‌های‌ زمینه‌ای‌ غیراختصاصی‌ افزایش‌می‌یابد و پایین‌ بودن‌ بیش‌ از حد غلظت‌ نیز باعث‌ کم‌ شدن‌ فرآورده‌های‌ مورد نظر می‌شود. برای‌تکثیرDNAژنومی‌ یک‌ غلظت‌ بهینه‌ ازTaqمعمولا حدود ۴-۱ واحد درصد میکرو لیتر واکنش‌توصیه‌ می‌شود.
● اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌
‌‌‌‌آنزیم‌ مناسب‌ و کنترل‌ عواملی‌ از جمله‌ غلظت‌ آنزیم، غلظت‌ قطعات‌ آغازگر، همانندسازی‌درجه‌ حرارت‌ دقیق‌ و زمان‌ نگهداری‌ محیط‌ عمل‌ در یک‌ درجه‌ حرارت‌ معین‌ و تعداد چرخه‌ در هرآزمایش‌ همه‌ در اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ اثر می‌گذارند.‌‌‌‌بطور کلی‌ عواملی‌ که‌ در کارآییPCR ‌ ایفای‌ نقش‌ می‌کنند عبارتند از:
غلظتMgCl۲ ‌، کیفیت‌ و کمیتDNA‌ الگو، بافرPCR، غلظتdNTP‌، افزاینده‌هایPCR‌،بازدارنده‌هایPCR ‌،Nested PCR،PCR با شروع‌ داغ، تعداد سیکلPCR ‌ و دمای‌ اتصال‌پرایمر
● مهار کننده‌ها و افزایش‌ دهنده‌هایPCR ‌
‌‌‌‌مواد لیست‌ شده‌ در جدول‌ ذیل‌ می‌توانند درPCR حاوی‌ نقش‌ باشند.‌‌‌‌ژلاتین‌ یا آلبومین‌ سرم‌‌۱۰۰ نانوگرم‌ در ۵۰ میکروگرم‌ واکنش‌‌‌فرمامید‌‌۵%، ‌‌دی‌متیل‌ سولفوکساید‌‌(DMSO) ۰۱-۲%‌‌پیروفسفاتاز‌‌واکنش‌واحد ۱۰۰/۰ – ۰۱،‌‌تترامتیل‌ آمونیوم‌ کلراید‌‌(TMAC) ۰۰۱-۰۱ میکرومول‌ ‌‌پلی‌اتیلن‌ گلایکول‌ ۰۰۰۶‌‌۵۱-۵ درصد،‌‌گلیسرول‌‌۵-۱ درصد،‌‌توین‌ ۰۲‌‌۵/۲-۱ درصد،‌‌پروتئین‌ ژن‌ ۲۳‌‌۲ نانومول‌،‌‌۷ دی‌اَز - َ۲‌dGTP-‌با ۵۷% جایگزین‌،‌‌پروتئین‌ تک‌ رشته‌DNA ‌‌۱واحد،‌‌کلی‌باسیل‌ ‌‌۱ واحد، ‌‌بتائین‌‌۵ میکروگرم‌ در میلی‌لیتر، ‌‌‌‌ژلاتین‌ یا آلبومن‌ سرم‌ حیوانی‌ به‌ غلظت‌ ۱۰۰ میکروگرم‌ بر میلی‌ لیتر و شوینده‌ غیریونی‌ مانندتوین‌ ۰۲ یا Laurth-۲۱ (۱/۰ تا ۵۰/۰) درصد برای‌ ثبوت‌ پایداری‌ آنزیم‌ اضافه‌ می‌شود.DMSO‌‌‌‌ ساختمان‌ ثانویهDNA ‌ هدف‌ را کاهش‌ می‌دهد. آزمایشات‌ نشان‌ داد. بطور سطحی‌ اثر بازدارندگی‌ بر رویTaq ‌ داشته‌ و باعث‌ کاهش‌ بازده‌ کل‌ شده‌ است. شوینده‌های‌غیریونی‌ نظیرTritonX۱۰۰ و توین‌۲۰ تا غلظت‌ ۵% مهار کننده‌ نیست‌ شوینده‌های‌ یونی‌ مانندسدیم‌ دودسیل‌ سولفات(SDS) ‌ فقط‌ در غلظت‌های‌ بسیار پایین‌ قابل‌ تحمل‌ است‌ و این‌ شوینده‌ باروش‌ استخراج‌ فنل‌ و رسوب‌ اتانل‌ قبل‌ ازPCR ازDNA حذف‌ می‌شود.SDS‌‌‌‌ در غلظت‌ ۲-۱ درصد استفاده‌ می‌شود در حالیکهTaq ‌ پلی‌مراز در غلظتهای‌ بالاتر. ۱ر۰درصدSDS مهار می‌شود.Taq‌‌‌‌ پلی‌مراز به‌ عمل‌ هضمی‌ پروتیئنازK حساس‌ است، بنابراین‌ پروتیئنازK بایستی‌ حذف یا غیرفعال‌ شود. دمای‌ ۵۹ درجه‌ سانتیگراد برای‌ رسیدن‌ به‌ چنین‌ هدفی‌ کفایت‌ می‌کند. تیمار کردن‌حرارتی‌ و سپس‌ استخراج‌ بوسیلهِ فنل‌ پروتیئنازK را واسرشت‌ می‌کند. آثار باقیماندهِ فنل‌ می‌تواندباعث‌ مهارPCR شود که‌ توسط‌ کلروفورم‌ حذف‌ می‌شود.
‌● شروع‌ داغ‌
‌‌‌‌چنانچه‌ لازم‌ باشد تعداد زیادی‌ نمونهِPCR آماده‌ گردد. ایجاد شرایط‌ یکنواخت‌ و مساوی برای‌ هر تیوپ‌ مشکل‌ است‌ علاوه‌ بر این‌ باز و بسته‌ کردن‌ تیوپ‌ برای‌ انجام‌ نمونه‌ برداری‌های‌مختلف‌ باعث‌ می‌شود که‌ خطر آلودگی‌ بالا رود. بنابراین‌ اجزای‌ واکنش‌ را بطور فیزیکی‌ با ماده‌ای‌ که‌بعنوان‌ مانع‌ بکار برده‌ می‌شود می‌توان‌ جدا کرد. هنگامیکه‌ این‌ ماده‌ در حین‌ بالا رفتن‌ دما ذوب‌می‌شود آن‌ ماده‌ عاملی‌ برای‌ مخلوط‌ شدن‌ تمام‌ اجزای‌ واکنش‌ بطور همزمان‌ در زمان‌ شروعPCR ‌می‌باشد
‌‌‌‌به‌ عنوان‌ مثال‌ در این‌ تکنیک‌ اجزای‌ ترکیب‌ شوندهPCR ‌ به‌ جزDNAپلی‌مراز و الگویDNAبا همدیگر مخلوط‌ می‌شوند. سپس‌ یک‌ عدد آمپلی‌ واکس‌ به‌ مخلوط‌ اضافه‌ می‌شود که‌ در۸۰-۷۵ درجه‌ به‌ مدت‌ ۱۰-۵ دقیقه‌ ذوب‌ می‌شوند سپس‌ اجازه‌ داده‌ می‌شود که‌ قطعه‌ مومی‌ خنک‌و به‌ حالت‌ جامد درآید و اجزای‌ باقیمانده‌ واکنش‌ که‌ شاملDNA ‌ پلی‌مراز و الگویDNA ‌ و بافرمی‌باشد بر روی‌ قطعه‌ مومی‌ اضافه‌ و تیوپها در ترموسایکلر قرار داده‌ می‌شوند. اگر ما موم‌ را ذوب‌کنیم، اجزایPCR ‌ به‌ همدیگر مخلوط‌ می‌شود و موم‌ به‌ سمت‌ بالا و در سطح‌ مایع‌ قرار می‌گیرد.پس‌ از اتمامPCR ‌ تیوپها در دمای‌ زیر ۳۵ درجه‌ خنک‌ می‌شوند و موم‌ به‌ حالت‌ جامد در می‌آید.
● PCR آشیانه‌ای‌
PCR‌‌‌‌ آشیانه‌ای‌ یکی‌ از راههای‌ افزایش‌ دقتPCR ‌ می‌باشد. در این‌ روش‌ از دو نوع‌ پرایمر استفاده‌ می‌شود. ابتدا پرایمر اول‌ اضافه‌ می‌شود و باعث‌ تکثیر قطعاتی‌ ازDNAمی‌شود که‌ احتمال‌دارد به‌ میزان‌ دلخواه‌ اختصاصی‌ نباشد سپس‌ پرایمر دوم‌ اضافه‌ می‌شود که‌ خصوصیات‌ آن‌ تکثیرقسمت‌ داخلی‌تر یا بعبارت‌ دیگر اختصاصی‌تر می‌باشد.‌‌‌‌در واقع‌ جفت‌ پرایمر دوم‌ پرایمرهائی‌ هستند که‌ داخل‌ جفت‌ اولیه‌ هستند و قطعات‌ طویلتربوسیله‌ اولین‌ دورP CRتولید می‌شوند به‌ عنوان‌ یک‌ الگو برایPCR ‌ دوم‌ بکار می‌روند.
● اثر فلات‌
‌‌‌‌کاهش‌ سودمندی‌ تکثیر و رسیدن‌ به‌ یک‌ سطح‌ ثابت‌ تکثیر در نتیجه‌ کاهش‌ مقدار آنزیم‌سیکل‌های‌ بعدی‌ را در اصط‌لاح‌ اثر فلات‌ در واکنش‌ تکثیری‌ گویند. این‌ فلات‌ درPCR باTaq خیلی‌دیرتر از واکنش‌ که‌ با آنزیم‌ کلنو انجام‌ می‌شود تشکیل‌ می‌شود و بطورکلی‌ اختصاصی‌ بودن‌ واکنش‌ راافزایش‌ می‌دهد.
● آلودگیهایPCR ‌
‌‌‌‌در عملPCR ‌ باید از تکثیر آلوده‌کننده‌هایی‌ مانندDNA های‌ تکثیر شده‌ در آزمایشهای‌ قبل جلوگیری‌ به‌ عمل‌ آید. منابع‌ زیادی‌ برای‌ آلودگیPCR ‌ وجود دارد که‌ در جدول‌ زیر آمده‌ است
● منابع‌ بالقوه‌ آلودگیPCR ‌
هود و تهیه‌ فیلترها‌‌، دستگاه‌ الکتروفوژ، لوله‌های‌ سانتریفوژ، وارد کردن‌ نوک‌ پپیت‌ به‌ ژل،ترموسایکلر، بلوک‌های‌ حرارتی، روشهای‌ جمع‌آوری‌ نمونه، آب‌ یا سیستم‌ خنک‌ کننده،‌ محیط‌ آزمایشگاه، پرسنل‌ آزمایشگاه، دستگاه‌ هموژنیزه‌ کننده‌ بافت‌
● منابع‌ بالقوه‌ آلودگی‌
‌‌‌‌برای‌ جلوگیری‌ از آلودگیPCR ‌ آزمایشات‌ باید در هود ویژه‌ یا حداقل‌ قسمتی‌ از آزمایشگاه‌ صرفا به‌ اینکار اختصاص‌ داده‌ شده‌ قرار گیرد. تجهیزات‌ و محلولهائی‌ که‌ مرتب‌ درPCR کاربرد داردباید تحت‌ نگهداری‌ ویژه‌ باشد‌‌‌‌هر ماده‌ که‌ قابل‌ اتوکلاو کردن‌ است‌ باید استریل‌ شود و از دستکش‌ در تمام‌ مراحل‌PCR ‌استفاده‌ کرد و همچنین‌ عینک‌ و روپوش‌ آزمایشگاهی‌ نیز لازم‌ است. محلولهائی‌ مانند بافر وdNTP باید در سیستمهای‌ بسته‌ نگهداری‌ شود و برای‌ جلوگیری‌ از آلودگی‌ محلول‌ پایه‌ را باید به‌ چندقسمت‌ تقسیم‌ نمود. در ذیل‌ بعضی‌ از روشها که‌ مانع‌ آلودگی‌ می‌شود ذکر شده‌ است‌
▪ اوراسیل‌ - ان‌ - گلیلوسیلاز (این‌ آنزیم‌ محصولات‌ قبلیPCR ‌ را از بین‌ می‌برد
▪ اشعه‌ ماوراء بنفش‌
▪ تیمار آنزیمی‌
▪ مدت‌ زمان‌ واسرشت‌ شدن‌
▪ درجه‌ حرارت‌ واسرشت‌ شدن‌
▪ تعداد چرخه‌
▪ استفاده‌ ازdUTP به‌ جایdTTP ‌،
● روغنهای‌ معدنی‌
‌‌‌‌روغنهای‌ معدنی‌ سبک‌ برای‌ پوشاندن‌ مخلوطPCR ‌ و جلوگیری‌ از تبخیر به‌ کار می‌روند بطورکلی‌ حدود ۶۰-۴۰میکرولیتر از روغن‌ به‌ ۱۰۰ میکرولیتر از محلولPCR ‌ اضافه‌ می‌شود روغن‌همچنین‌ از آلودگی‌ نمونه‌ها جلوگیری‌ می‌کند چنانکه‌ سرپوش‌ ترموسایکلر گرم‌ شود احتیاجی‌ به‌پوشش‌ با روغن‌ نمی‌باشد روغن‌ را با پیپت‌ یا استخراج‌ با کلروفورم‌ براحتی‌ می‌توان‌ خارج‌ ساخت‌

منبع: آرش جوانمرد. بررسی چند شکلی ناحیه پروموتور ژن گیرنده هورمون رشد در گاوهای سیستانی. پایان نامه کارشناسی ارشد- دانشگاه تهران فارغ التحصیل رشته ژنتیک و اصلاح نژاد دانشگاه تهران
http://www.parsbiology.com/discuss/article.aspx?AID=۶۹&TID=۴

منبع : بانک مقالات فارسی