«فوتو فرین» به عنوان یک حساس کننده رادیویی در یک مطالعه سلولی به صورت In Vitro

تغییر دهنده های شیمیایی (حساس کننده هاََی پرتوی) به منظورافزایش تاثیر پرتودرمانی استفاده می شوند. استفاده از فوتودینامیک تراپی (PDT) در درمان تومورها به خصوص با فوتوفرین II نیز شناخته شده است . در حال حاضر هیچ تغییر دهنده شیمیایی که به صورت حساس کننده رادیویی انتخابی عمل کند شناخته نشده است.آزمایش های مختلفی با سریهای مختلف خطوط سلولی انجام شده اند ، خط سلولی سرطان مثانه انسان (RT۴) ، سلولهای آدنوکارسینومای کولون (HT-۲۹) وسلولهای گلیوبلاستوما (U-۳۷۳ MG) پیش از تابش دهی با و بدون آنکوباسیَون با فوتوفرین II مورد بررسی قرار گرفتند . تابش دهی با استفاده از دوزهایی از۰ تا ۸Gy انجام شد. آزمونهای تشکیل کولونی برای بررسی و تعیین تاثیرفوتوفرینII به عنوان حساس کننده رادیویی در مقابل تشعشع به تنهایی به کاررفت . دو خط سلولی مورد بررسی قرار گرفته RT۴ و U-۳۷۳ MG،به همراه فوتوفرین II قبل از تابش نشان از حیات سلولی کمتری در مقایسه با سلولهای فوتوفرین وتحت تابش داشت. برای سلولهایHT-۲۹ نتایج تفاوتی بین دو گروه نشان نداد(با و بدون فوتوفرین). نتایج این مطالعه نشان داد که فوتوفرین II می تواند در شرایطی معین به عنوان یک حساس کننده رادیویی بکار رود .
فوتودینامیک تراپی (PDT) به عنوان روشی مورد قبول برای درمان انواع مختلفی از تومورهای جامد شناخته شده است[۲-۱] این روش شامل تجویز موضعی یا سیستمیک یک عامل حساس کننده به نور است که به طور قابل ترجیحی دربافت تومور مجتمع می شود و باعث درخشش نواحی نئوپلاستیک با نور های با طول موج خاص که به وسیله حساس کننده نوری جذب می شود می گردد. در این ارتباط ،فوتوفرین وآنالوگهای آن مهمترین و شایع ترین حساس کننده های نوری هستند .
مدارهای تتراپیرولیک آن پهنای جذبی در ناحیه نور قرمز(۶۰۰-۸۰۰nm) طیف مرئی ایجاد می کنند که دارای قدرت ونفوذ نسبتاً بالایی به بافت های انسانی هستند[۳] و بوسیله ترکیبات درونی سلول جذب نمی شوند بنابراین صدمات معمول ناشی از نور را به حداقل می رسانند. به طور خاص فوتوفرین II ، ترکیبی پیچیده از پورفرین مشتق از تغییرات شیمیایی هماتو پورفرین (HP) [۴] ،اخیراًًً برای PDT تومورهای خاص در سطوح بالینی در کشورهای مختلف تایید شده است. در حال حاضر هزاران بیمار درسراسر جهان تحت PDT با فوتوفرین قرار گرفته اند و نتایج آن مثبت بوده است[۲،۱].
با این حال PDT با فوتوفرین دارای محدودیتهای مهمی است نظیر ضریب بقا مولی کم در ناحیه طیفی قرمز مهم برای درمان که ضریب فعال سازی آن بوسیله نور را محدود می سازد. به علاوه حداکثر جذب نور قرمز فوتوفرین مربوط به طول موج ۶۳۰nm است که در آن قدرت نفوذ به بیشتر بافتهای بدن کاهش یافته است. به همین دلیل درمانهای مکرراغلب ضروری هستند [۲،۱]، در نتیجه استفاده از PDT در ترکیب با سایر روشهای درمانی مثل پرتو درمانی مورد بررسی قرار گرفته است[۷،۵،۱،] به طور کلی آثار بیولوژیک تشعشع در ارتباط با تومور و بافتهای طبیعی قابل تغییر بوده و با روشهای دزیمتری کامپیوتری می توان به طور انتخابی آنها را بهبود بخشید . یک روش موازی بر اساس معرفی آثار واکنشی تشعشع است که بر اساس بیولوژی سلولی بنا نهاده شده است (مثل اکسیژناسیون،سیکل سلولی و.....) و می توان بوسیله مواد شیمیایی (حساس کننده ها، محافظت کننده ها و شیمی درمانی) که به عنوان حساس کننده های تشعشعی عمل می کنند آنها را تغییر داد. این تغییر برای دسترسی به حداکثر تاثیر بر بافتهای تومورال وهمچنین به حداقل رساندن آثار بر روی بافت سالم ضروری است[۶] .
در هنگام استفاده از عوامل حساس کننده پرتوی همیشه باید دو عامل را مدنظر داشت: احتمال کنترل موضعی تومور (TCP) و نسبت پیچیدگی بافت سالم (NTCP) که هر دو در بهره درمان (TR) موثر هستند. بیشتر عوامل حساس کننده پرتوی شناخته شده و مورد استفاده به مقدار بسیار کمی انتخابی بوده وبرای تومور اختصاصی نیستند. استفاده از این ترکیبات به دلیل سمی بودن ذاتی آنها می تواند منجر به عوارض جانبی شدیدی شود [۶].
نتایج منتشر شده در دهه های ۱۹۵۰و ۱۹۶۰بوسیله choen [۷-۹] وپس از آنها بوسیله سایرین[۱۰و۸] نشان داد که مشتقات هماتوپوروفین (HPD)، یکی از مشتقات شیمیاییHP بسیار غیر یکنواخت از Hp ،که در بین آنها فوتو فرین II تا حدودی شکل خالص تری دارد [۴] می تواند به عنوان یک حساس کننده پرتویی به کار رود. به علاوه افزایش کشتار سلولی ناشی از تشعشع بوسیله متالوپورفرین های مصنوعی نیز گزارش شده است[۱۱].
مقالاتی که اخیراًمنتشر شده اند[۱۳و۱۲] مزایای استفاده از حساس کننده های نوری نظیر گادولونیم تگزافرین (Gd-Tex)را در درمان متاستازهای مغزی نشان داه اند. سایر مقالات منتشر شده بر روی مدلهای تومورmurine تاثیر In vivo فوتوفرین II را به عنوان یک عامل حس کننده پرتوی اختصاصی وانتخابی اثبات کرده اند [۱۴-۱۶]در این مطالعات حیوانی کارایی عملکرد حساس کننده های پرتویی بر حسب زمان دو برابر شدن تومورها بررسی شده اند .
هدف از این مقاله بررسی تاثیر حساس کننده پرتوی فوتوفرین II بر سه خط سلولی مختلف به صورت In Vitro است که دو تا از این خطوط (سلولهای سرطان مثانه انسان وگلیوبلاستوها)در In vivo مقابل تشعشع مقاوم می باشند.
● مواد وروشها
▪ مواد شیمیایی:
فوتوفرین به صورت منجمد تهیه شد و درPBS با غلظت۲.۵mg/ml ذخیره شده و تا زمان استفاده در دمای-۲۰c نگهداری شد.نگهداری، مراحل ترقیق و دوره انکوباسیون آن تحت شرایط آزمایشگاهی وبدون تحت تابش نور قرار گرفتن انجام شد .
▪ خطوط سلولی:
در این مطالعه سه خط سلولی سرطانی انسان قرار گرفته است. سلولهای کار سینومای تمایز یافته پاپیلاری مثانه انسان RT۴ و خط سلولیU-۳۷۳MG گلیوبلاستوما انسانی .هر دو خط سلولی به صورت In vivo در مقابل تشعشع مقاوم هستند[۱۷-۲۱]. خط سلولی سوم سلولهای آدنوکارسینومای انسانیHT-۲۹ هستند که به تشعشع حساس می باشند[۲۲]
« شرایط نگهداری سلولها در اصل مقاله موجود است »
▪ درمان سلولها:
آزمایشات در ظروف با ۴well انجام شدند. سلولهای RT۴ به تعداد ۲۰۰ سلول در هر well کشت شدند و این well ها تحت تابش o-۶Gy قرار گرفتند. گروه دیگری از ظروف حاوی۱۰۰۰ سلول در هر well تحت تابش ۸Gy قرار گرفتند. تعداد بیشتر سلولها در ظرف دوم برای جبران آهنگ کم بقا سلول در اثر تشعشع بیشتر بود. سلولهای U-۳۷۳MG (سلولهای گلیوبلاستوما) و سلولهای HT-۲۹ (سلولهای آدنوکارسینومای کولون) در دانستیه های۱۰۰ ،سلول(۲Gy،۰) ، ۲۰۰ سلول(۴Gy) ،۶۰۰ سلول (۶Gy) و۱۰۰۰ سلول(۸Gy) در هر wellکشت شدند و این مقادیر بر اساس یافته های قبل که مقدار کشت بهینه به ازای دوز تشعشع را نشان می دادند ، محاسبه شدند . ظروف سلول در اتاقکی تاریک و با رطوبت بالا نگهداری شدند تا از فعال شدن پروفرین IIجلوگیری شود. پس از۲۴ ساعت ، محیط دور ریخته شدو ۳ml از محلول فوتوفرین- µPBSبا غلظت نهایی ۱µg/mlبه هرwell اضافه شد . این غلظت ها پس از آزمایش سمیت با غلظت های مختلف فوتوفرینII به دست آمدند انکوباسیون سلول با PBS بدون فوتوفرین نیز به عنوان کنترل انجام گرفت . پس از تابش به سلولها و حضور۱ ساعته در انکوباتور ، محتوای فوتوفرین تخلیه شدو با ۳mlمحیط کشت تازه جایگزین گشت. سپس سلولهایی که فوتوفرین برداشت کرده بودند تحت تابش پرتوهای یونیزان قرار گرفتند (با سیستم اشعهMuller RT ۲۵۰ x ، ۲۲۵KV ،۱۵mA، فیلتر ۰.۳۵مس وآهنگ دوزo.۹Gy/min) با دوزهای۲،۴،۶، Gy ۸به ترتیب .درخلال تشعشع سلولها در ۳۷۰c نگهداری شدند. سلولهای کنترل نیز در شرایط مشابه ولی بدون تشعشع نگهداری شدند.
▪ آماده سازی ورنگ امیزی کولونی :
پاسخ سلولها به تشعشع با تعیین حیات سلولی ارزیابی شد. کولونی های با بیش از ۵۰ سلول در۱۳ روز پس از کشت بررسی شدند . آماده سازی ورنگ آمیزی کولونی ها برای هر ۳ خط سلولی انجام گرفت . برای آماده سازی کولونی ها محیط کشت دور ریخته شد و ۳ml آلیکوت ثبوت(۲حجم اتانول با اضافه ۱حجم اسید استیک ) به هرwell اضافه شد . پس از ۵ دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق ثابت کننده با محلول رنگ آمیزی جایگزین شد و ۳۰ دقیقه دیگر به همین حال ماند . سپس مواد رنگی دور ریخته شدند و سلولها شسته شده وخشک گردیدند.
▪ بررسی حیات سلول :
آزمایش سمیت غلظتهای مختلف فوتوفرین Mg/ml ، در دو آزمایش مختلف با ظروف با ۴well بررسی شد. هر ترکیب متفاوتی بین دوز فوتوفرین و دوز تشعشع در آزمایشات جدا که ۳ بار تکرار می شد بررسی گشت و۲۴ گروه اطلاعات به دست آمد. بررسی کولونی ها تحت میکروسکوپ استریو انجام شد. سلولهای زنده آنهایی بود که کولونیهایی با ۵۰ سلول یا بیشتر تشکیل میدادند. تستt باP≤ ۰.۰۵ برای ارزیابی تشخیص آماری نتایج انجام شد . برای جلوگیری از تاثیر ضریب کشت های مختلف در آزمایشات متعدد تعداد کولونیهای محاسبه شده برروی ۱۰۰ تنظیم شدند . برای این محاسبه تعداد محاسبه شده کولونیها را در یک فاکتور که برای هرآزمایش جداگانه تعیین می شود ضرب می کردیم . این فاکتور از تقسیم تعداد سلولهای کشت شده به تعداد سلولهای شمرده شده در آزمایش کنترل یعنی بدون انکوباسیون فوتوفرین وبدون تشعشع محاسبه شد . بنابراین کارایی کشت هر آزمایش در همان محاسبات به کار رفت.
▪ فاکتورتغییر دوز:
منحنی های بقا با و بدون فوتوفرین II برای هر سه خط سلولی تهیه شدند و فاکتور تغییر دوز (DMF) با تقسیم دوز تشعشع بدون فوتوفرین به دوز تشعشع با فوتوفرین در همان سطح بقا محاسبه شد.
● نتایج:
واضح است که هیچ تفاوت قابل توجهی وجود ندارد ونشان می دهد مقدار سمیت برای تمامی خطوط سلولی با غلظت ۱µg/ml قابل آشکار سازی نیست. در مقایسه با سلولهای تحت تابش بدون فوتوفرین II کاهش مشخص در میزان بقا (P≤ ۰.۰۵درتستt) سلولها در سلولهای RT۴و U-۳۷۳که پس از انکوباسیون با فوتوفرین II تحت تابش قرار گرفتند مشاهده شد. DMFبرای سلولهای RT۴ بین ۱.۱در میزان بقا۵۰%و ۱.۲در میزان بقا۵%وبین ۱.۲ و۱.۳ در میزان بقا ۵۰%و۵% به ترتیب برای سلولهای U-۳۷۳ بود.
در سلولهای HT-۲۹ هیچ تفاوتی بین دو روش درمان مشاهده نشد.تنها پس از تابش ۶Gy ،کمی اثر افزایشی مشاهده شد . هیچ افزایشی از DMFدر سلولهای HT-۲۹ مشاهده نشد.
● بحث وبررسی
بحث وبررسی نتایج حاضر اثبات می کند که فوتوفرینII در شرایط آزمایشی صحیح می تواند به عنوان یک عامل حساس کننده پرتوی به خصوص در خطوط سلولی که به صورت In vivo در مقابل تشعشع مقاومند نظیر سلولهای RT۴ و U-۳۷۳به کار رود(۱۷-۲۱) .
چنین اثری در سلولهای HT-۲۹ که به تشعشع حساس می باشند مشاهده نشد(۲۲) .کاهش حیات سلولی پس از انکوباسیون با فوتوفرین II وتشعشعات یونیزان از نظر آماری در تست t برای دو خط سلولی RT۴ و U-۳۷۳ تفاوت معنی داری داشت.
نتایج ما با مقاله هایی که اخیراً منتشر شده اند(۱۴-۱۶) و نشان داده اند که فعالیت حساس کنندگی فوتوفرین بر کارسینومای مثانه وتومورهای سارکومای Lewisکه تومورهایی هایپوکسیک ومقاوم به تابش هستند نیز وجود دارد مطابقت دارند(۱۸,۲۰,۲۱,۲۳). با این وجود اثر حساس کنندگی که در مطالعه In Vitro نشان داده شد به مقدار متوسط بود که باDMF برابر۱.۳ نشان داده شد. مطالعات In vivo با وبدون فوتوفرین در طول تابش نشان از افزایش زمان دوبرابر شدن تومور با روش ترکیب تشعشع وفوتوفرین داشت. وقتی از غلظت های بالاتر فوتوفرین II استفاده کردیم (۲,۴µgr/ml)مقادیر DMF پس از تشعشع افزایش یافت. با این وجود ما آزمایش رابا این غلظتها ادامه ندادیم چون افزایش مرگ سلولی (اثر حساس کنندگی تشعشع) می تواند بوسیله ترکیب اثر تشعشع و اثر سمیت پوروفین باشد.
درجات متفاوت کارایی که بین اثر حساس کنندگی تشعشع در آزمایشات In Vitro و In vivo رخ می دهد می توان به دلیل شرایط متفاوت محیط سلولها در بافت و باشد در عوض هیچگونه شرایط هایپوکسیک در طول آزمایشات In Vitro برقرار نبود. می توان فرض کرد اثر حساس کنندگی فوتوفرین در سلولهایی که نیاز کمی به اکسیژن برای متابولیسم دارند بیشتر است. با این وجود برای آزمایشات In Vitro نمی توان شرایط هایپوکسیک فرض کرد. در مشاهدات ما فقط دو خط سلولی به عنوان مقاوم به تشعشع در In Vitro شناخته می شدند که در حضور فوتوفرین II به صورت In Vitro حساس به تشعشع بودند.
درک کامل این واکنش متضاد بین دو خط سلولی RT۴ و U-۳۷۳ و HT-۲۹ برای ما روشن نیست. اطلاعات اخیر نشان داده اند که بیان بیش از حد گیرنده فاکتور رشد EGFR با مقاومت تشعشعی همراه است (۲۷) و می تواند این تفاوت را توضیح دهند. اثر مقاومت پوروفرین و مشتقات دیگرش کمتر تحت توجه بوده است لذا گزارش هایی تاثیر آنرا را بر سلولهای هایپوکسی In Vitro از اتانیدازول نشان می دهند(۶) .در این ارتباطHpD،تا حدودی موثر نشان می دهد . بیشتر مقالات تاثیر این روش درمان با استفاده HpDرا گزارش کرده اند (۲۴و۱۰و۹و۷و۵). درک کمی از مکانیسم حساس کنندگی تومور بوسیله فوتوفرین وجود دارد. تعدادی از مونومرهای پورفرین از هر گونه فعالیت حساس کنندگی در سلولها خودداری می کند . پیشنهاد شده است که حساسیت تشعشعی شدیدی که بوسیله فوتوفرین به نمایش درمی آید با انواع پورفرین الیگومریک در ارتباط است.
چنین الیگومرهایی می تواند با محیط های سمی برای سلول نظیر رادیکالهای هیدروکسیل که در نتیجه بر هم کنش اشعه با آب تولید می شوند واکنش نشان دهند . در نتیجه تعداد زیادی انواع رادیکال در طول یک زنجیره واکنش با فوتوفرین تشکیل می شوند . بنابراین فوتوفرین می تواند به عنوان یک عامل تقویت کننده تشعشع عمل کند .چنین مکانیسم عملی قبلاّ در مورد پورفرین دیگری به نام GD-Tex که به عنوان حساس کننده تشعشعی استفاده می شود، به اثبا ت رسیده بود۲۶)و(۱۳به علاوه ممکن است در حضور فوتوفرین ، فرایند ترمیم آسیب سلولی زیر کشنده پس از تابش پرتوهای یو نیزان منع شود و لذا به کنترل تومور کمک می کند . به علاوه تحقیقاتی برای درک مکانیسم فرایند منجر به حساس کنندگی فوتوفرین انجام شده اند.
به طور کلی در شرایط بی هوایی دوز تشعشع برای دستیابی به همان درجه از سمیت سلولی باید با فاکتور۲.۵ تا ۳نسبت به شرایط اکسیژن دار افزایش یابد (۲۶) .چون سلولهای هایپوکسیک در مقایسه با سلولهای اکسیژن دارمقاوم به تابش هستند حتی جز کوچکی از سلولهای هایپوکسیک در یک تومور بر پاسخ تومور به تشعشع تاثیر می گذارد. مطالعه ما و سایر مطالعات نشان داد که پورفرین ومشتقاتش ۳ تا ۷ بار بیشتر از بافت نرمال در تومور مجتمع می شوند ونشان از انتخابی بودن آن برای تومور دارد. این انتخاب دارای مزایایی است ، فوتوفرین قبلاٌ مجوز استفاده بالینی در PDT تومورها را دریافت کرده است ودر دوزهای مفید درمانی هیچ خاصیت سمی برای انسان ندا رد(۱-۴). درمقابل می دانیم که حساس کننده های مورد استفاده خاصیت انتخابی خیلی کمی دارند و می توانند به صورت In Vivo عوارض جانبی شدیدی ایجاد کنند (۶).
در حقیقت اولین استفاده بالینی از فوتوفرین به عنوان یک حساس کننده پرتوی تومور در حال حاضر با نتایج امیدوارکننده ای در جریان است (۸). عوارض جانبی مشاهده شده رژیم درمانی با عوارض ناشی از پرتو درمانی روتین خیلی متفاوت نیست . متابولیسم فوتوفرین در بدن از بیماری به بیمار دیگر متفاوت است و به عوامل متعددی بستگی دارد(۲۸). در حال حاضر ما به شدت در حال انجام تحقیقاتی هستیم تا تعاریف دقیق تری از پارامترهای منفرد افزایش دهنده یا کاهش دهنده خاصیت حساس کنندگی فوتوفرین II و موقعیت های بالینی خاص که درمانهای تشعشعی با فوتوفرین در آنها مفید می باشند مشخص شود.

نویسنده مقاله: Ulrike Kulkaو همکاران

منبع : جامع علوم رادیولوژی ایران