کلونینگ ژن کدکننده آنتی ژن سطحی ویروس هپاتیت B در اشرشیاکولی

● زمینه و هدف:
عفونت ویروس هپاتیت B در سراسر جهان آندمیک است. حدود ۳۵۰ میلیون ناقل ویروس هپاتیت B در جهان وجود دارد. حدود یک میلیون نفر در سال به دنبال عفونت ویروس هپاتیت B تلف می شوند. متاسفانه دارویی که بتواند به درمان کامل هپاتیت B بیانجامد، وجود ندارد و تنها راه جهت کنترل اپیدمی ها، انجام واکسیناسیون می باشد. اندازه گیری مقدار DNA ویروسی برای شناسایی افرادی که دارای عفونت مزمن هستند، مورد استفاده قرار می گیرد، همچنین برای بررسی و پیش بینی سیر درمان بیماری و تاثیر داروهای ضد ویروسی در رژیم های درمانی کاربرد دارد. با معرفی Real-time PCR در آزمایشگاه های تشخیص طبی، اندازه گیری کمی DNA ویروس در نمونه های بالینی به طور معنی داری توسعه پیدا کرده است. هدف از این مطالعه، کلونینگ و شناسایی ژن کدکننده آنتی ژن سطحی ویروس هپاتیت B به عنوان استاندارد خارجی است.
● روش بررسی:
این تحقیق یک مطالعه توصیفی می باشد. برای تکثیر ژن S، ابتدا ژنوم ویروس از نمونه سرم که از نظر (Hepatitis B surface Antigen)HbsAg مثبت بود، استخراج شد. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، قطعه ای از ژن S با روش PCR (Polymerase chain reaction) تکثیر شد. برای کلونینگ ژن S از یک کلونینگ وکتور pTZ-۵۷R(فرمنتاس) استفاده گردید. پس از خالص سازی، محصول PCR به داخل وکتور پلاسمیدی کلون شد و به داخل سلول مستعد E.Coli سویه TG۱، ترانسفورم شد. باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب با روشهای مختلف از قبیل مقاومت به آنتی بیوتیک، PCR، برش با آنزیم های اختصاصی و در نهایت تعیین توالی، مورد بررسی قرار گرفت. برای آنالیز آماری، از آزمون t و محاسبه میانگین تعداد کلنی های شمارش شده بر روی پلیت های حاوی آنتی بیوتیک و بدون آن، استفاده گردید.
● یافته ها:
پس از استخراج DNA ویروسی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، ژن S با روش PCR تکثیر شد و قطعه ای شامل ۱۷۵ جفت باز حاصل گردید، سپس ژن S با استفاده از پلاسمید pTZ۵۷R کلون گردید. پلاسمید نوترکیب استخراج شد و با روش PCR و برش آنزیمی، مورد تایید قرار گرفت. برای تایید نهایی، پلاسمید نوترکیب تعیین توالی شد.
● نتیجه گیری:
نتایج حاصل از این مطالعه نشان می دهد که قطعه ۱۷۵ جفت بازی ژن S در پلاسمید pTZ۵۷R کلون گردیده است که می توان از آن، جهت تهیه استاندارد Real-time PCR یا کنترل مثبت در آزمایش ها استفاده نمود.

زهره شریفی
فاطمه یاری
محمود محمودیان شوشتری
شهرام سمیعی

منبع : پایگاه اطلاعات علمی