ساخت پلاسمید نوترکیب جدید حامل دو ژن خودکشی سلولی HSV-tk و Yeast-cd به منظور دستکاری ژنتیکی لیشمانیا

● مقدمه:
لیشمانیوز یک بیماری انگلی است که گسترش جهانی دارد و عامل آن تک یاخته ای از جنس لیشمانیاست این بیماری دارای اشکال گوناگونی شامل لیشمانیوز جلدی، لیشمانیوز جلدی – مخاطی و لیشمانیوز احشایی است. ۳۵۰ میلیون نفر در سراسر دنیا در معرض ابتلا به لیشمانیوز می باشند و سالانه چهارصد هـــزار مورد جدید گزارش می گردد و در حـــدود ۱۲میلیون نفر نیز به این بیماری مبتلا هستند . از آنجا که کشور ما دارای شرایط آب و هوایی مناسب برای رشد و تکثیر ناقلین و مخازن این بیماری است، لذا این بیماری از اهمیت ویژه ای برخوردار است .انتقال ژنهایی که در بر دارنده فنوتیپ مقاومت و یا حساسیت به عوامل دارویی مختلف می شوند و یا سبب انتخاب مثبت یا منفی می گردند، در حال حاضر یک تکنیک بسیار مهم در مطالعات ژنتیک مولکولی و بیولوژی سلولی به شمار می آیند. یکی از کاربردهای انتقال ژن، انتقال ژنهای خودکشی سلولی (Suicide genes) است. محصول یک ژن خودکشی سلولی در اغلب مواقع یک آنزیم است. آنزیم هایی مانند تیمیدین کیناز ویروس هرپس، تیمیدین کیناز ویروس واریسلا زوستر و سیتوزین دآمیناز مخمر ساکارومایسس سرویزیه از جمله آنزیم های سیستم خودکشی سلولی محسوب می شوند. این آنزیم ها قادرند که پیش داروها (Prodrugs) را به فرم توکسیک تبدیل کنند و این آنابولیت ها از سنتز اسیدهای نوکلئیک جلوگیری می کنند. درمان با پیش دارو سبب اثراتی می شود که تنها محدود به سلول های بیان کننده ژن بوده و ایجاد سمیت سیستمیک قابل توجه نمی کند . یکی از اصول استفاده از ژنهای خودکشی سلولی، انتخاب ترکیب آنزیم - پیش دارو می باشد. از جمله ژنهایی که در این راستا به کار گرفته شده اند، ژن تیمیدین کیناز ویروس هرپس سیمپلکس تیپ یک (HSV-۱ tk) و سیتوزین دآمیناز ساکارومایسس سرویزیه (Yeast-cd) می باشد. این دو ژن به ترتیب در حضور دو داروی گانسیکلوویر و ۵- فلوروسیتوزین، سیستم خودکشی سلولی یا به عبارتی ترکیب آنزیم – پیش دارو را تشکیل می دهند. یعنی محصول ژنهای tk و cd در اثر تغییراتی که روی داروهای گانسیکلوویر و ۵- فلوروسیتوزین می دهند آنها را به مواد سمی مبدل می سازند که برای سلول حامل این ژنها مرگ آور است . در سال ۱۹۹۰ برای اولین بار ژن tk در پلاسمیدی کلون گردید و وارد سلول لیشمانیا شد که در سالهای بعد از این انگل مهندسی شده جهت واکسیناسیون موشهای balb/c استفاده شد و نتایج حاصل از آن موفقیت آمیز بود . در مطالعه ای دیگر با استفاده همزمان از دو ژن tk و cd ایجاد لیشمانیای نوترکیبی شده است که در واکسیناسیون موشهای balb/c و C۵۷bl/۶ به کار برده شده و مقاومت بالایی علیه لیشمانیا پدید آورده است . هدف از این تحقیق، طراحی و ساخت یک کاست ژنی جهت انتقال و ادغام ژن های سیستم خودکشی سلولی (tk و cd) در ژنوم لیشمانیا می باشد.
● روش بررسی:
برای انجام این تحقیق از مواد و وسایل زیر استفاده شد: ژنهای مورد نیاز برای انجام این مطالعه، به همراه حاملین آنها از مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی انستیتو پاستور ایران گرفته شدند. به این صورت که ژن cd به همراه حامل آن، یعنی پلاسمید pGEM به صورت سازة pGEM(cd) و ژنهای tk و &#۹۴۵;tub با پلاسمید pBluscript به شکل pBluscript (tk-&#۹۴۵;tub) دریافت شد. آنزیم های برش دهندة مورد نیاز، شامل Xba I، Spe I، Not I و Sal I بوده که همگی از شرکت Fermentas کشور آلمان تهیه گردیدند. آنزیم لیگاز بکار رفته در مراحل انجام این تحقیق ساخت شرکت Invitrogen کشور آمریکا بوده و کیت استخراج پلاسمید، از شرکت Core One کشور کره جنوبی خریداری شد. باکتری E. coli سویه Top۱۰F، کیت تخلیص DNA از ژل، پودرآگارز، آنزیم Taq polymerase و بافرهای مربوطه از شرکت سیناژن ایران تهیه شد.
▪ روشها:
به منظور ساخت کانستراکت مناسب برای وارد سازی ژنهای HSV-tk و Yeast-cd به درون ژنوم لیشمانیا به صورت زیر عمل شد: قطعات ژنی تیمدین کیناز، سیتوزین دآمیناز و آلفاتوبولین باید به ترتیب tk-&#۹۴۵;tub-cd در کنار هم قرار گیرند. قطعه ژن cd در پلاسمید pGEM و قطعات ژنی tk-&#۹۴۵;tub در پلاسمید pBluscript قرار داشتند. همانطور که در بالا اشاره شد، این قطعات ژنی به همراه حاملین آنها از مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی انستیتو پاستور ایران گرفته شدند و سایر مراحل تحقیق در مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشـگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انجام شد. پلاسمید pGEM حامل ژن cd که با نماد pGEM(cd) نمایش داده می شود، به منظــــور خارج ســاختن قطعه ژن cd از آن، تحت تأثیر آنزیـــم های برش دهندة Xba I و Spe I قرار داده شـــد و پس از الکتروفورز روی ژل آگارز ۱ درصد، قطعـــه ژن cd با اندازه bp۵۰۰ از ژل بریده شد و با استفاده از کیت استخراج DNA از ژل، قطعه ژن مذکور از ژل آگارز تخلیــص گردید. از طرف دیگر، پلاسمید pBluscript حامل ژنهای تیمیدین کیناز و آلفا توبولین، که با نماد pBluscript (tk-&#۹۴۵;tub) نشان داده می شود نیز با آنزیم Xba I، بریده شد و به صورت یک مولکول DNA خطی در آمد و مراحل الکتروفورز و خالص سازیاز ژل آگارز مطابق آنچه در بالا گفته شد، صورت پذیرفت. بین قطعه ژن cd و مجموعه pBluscript (tk-&#۹۴۵;tub) با استفاده از آنزیم لیگاز، عمل Ligation انجام شد و محصول این مرحله در باکتریE. coli سویه Top۱۰F، ترانسفرم گردید. بعد از کشت باکتری ترانسفرم شده مذکور و تشکیل کلنی، استخراج پلاسمید با استفاده از کیت تخلیص پلاسمید انجام شد و صحت تشکیل کانستراکت pBluscript (tk-&#۹۴۵;tub-cd) با هضم برشی توسط آنزیم های محدودالاثر، مورد بررسی قرار گرفت.برای ساخت کاست ژنی متناسب با ژنوم لیشمانیا که قادر به انتقال مجموعه ژنی tk-&#۹۴۵;tub-cd به محل زیر واحد کوچک ریبوزوم باشد، از وکتور pF۴X۱.۴sat استفاده شد. این وکتور دارای خصوصیات زیر می باشد: بخش هـــای ۵ssu و ۳ssu که در دو سر هر یک از آنها سایت بـــرشی برای آنزیــم Swa I وجود دارد. نواحی ۵ssu و ۳ssu برای درج ژن در ژنوم لیشمانیا از طریق پدیده Homologous recombination دارای نقش اساسی می باشنــد. نـــواحی utr۱، utr۲ و utr۳ در عمــل Post-transcriptional نقش دارند و به mRNA Processing پس از رونویسی کمک می کنند. ژن sat به عنوان مارکر انتخابی مثبت، نقش ایجاد مقاومت به آنتی بیوتیک نورزئوترایسین را بر عهده دارد. ژن bla در سلولهای ترانسفکت شده با این پلاسمید، مقاومت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین را ایجاد می کند. بخش ori نیز محل شروع همانند سازی پلاسمید را تعیین می کند. ناحیه Stuffer شامل یک قطعه bp ۷۰۰ می باشد که در دو انتهای آن، سایتهای برشی مناسب برای آنزیم های برش دهنده، وجود دارد. ژنهای مورد نظر برای کلونینگ، در این قسمت وارد می شوند. در واقع این عمل با خارح ساختن Stuffer و جایگزینی ژنهای مورد نظر، به جای آن صورت می گیرد (تصویر شماره ۱).با توجه به اینکه کانستراکت نهایی از قرار دادن قطعات ژنی tk-&#۹۴۵;tub-cd در وکتور pF۴X۱.۴sat حاصل می¬شود، ابتدا ساختار پلاسمیدی حاصل از مرحله قبل یعنی کانستراکت pBluscript (tk-&#۹۴۵;tub-cd)، تحت اثر آنزیم های برش دهنده Not I و Sal I قرار گرفت و مجموعة ژنی tk-&#۹۴۵;tub-cd به صورت یکجا از آن خارج گردید و پلاسمیــد pF۴X۱.۴sat نیز با آنـزیم های برش دهنده Not I و Sal I، بریده شد و پس از انجام الکتروفورز روی ژل آگارز ۱ درصد و خروج قطعه Stuffer از آن، خالص سازی پلاسمید خطی شده pF۴X۱.۴sat از ژل آگارز مطابق روش ذکر شده در بالا، انجام پذیرفت و بین وکتور مذکور و مجموعة ژنی tk-&#۹۴۵;tub-cd، عمل Ligation با استفـــاده از آنزیم لیگاز، انجام شد . محصول Ligation در باکتریE. coli سویه Top۱۰F ترانسفرم گردید و به منظور تأیید کانستراکت نهایی از هضم برشی توسط آنزیم های محدودالاثر و تکنیک PCR بهره گرفته شد .
تصویر شماره ۱: تصویر شماتیک وکتور pF۴X۱.۴sat.
● یافته ها:
قطعات ژنی tk-&#۹۴۵;tub-cd در پلاسمید pBluscript با ترتیب صحیح در کنار هم قرار گرفتند و پس از کنترل های نهایی و تأیید حضور تک تک این ۳ قطعه ژن و تأیید قرار گرفتن آنها در محل مناسب در کانستراکت pBluscript (tk-&#۹۴۵;tub-cd)، این مجموعه ژنی به صورت یکجا در پلاسمید pF۴X۱.۴sat کلون گردید (تصویر شماره ۲).
تصویر شماره ۲: تصویر شماتیک کانستراکت نهایی pF۴X۱.۴sat (tk-&#۹۴۵;tub-cd) که سه ژن تیمیدین کیناز، آلفاتوبولین و سیتوزین دآمیناز در آن کلون گردیده اند.
تصویر شماره ۳: آزمایش PCR برای تأیید حضور تیمیدین کیناز و سیتوزین دآمیناز در کانستراکت نهایی pF۴X۱.۴sat (tk-&#۹۴۵;tub-cd).
▪ انجام PCR برای ژن cd که باند bp۵۰۰ مربوط به این ژن را نشان می دهد.
▪ کنترل منفی مربوط به ژن
▪ cd. مارکر ۱kb ساخت شرکت
▪ Fermentas. - نتیجه واکنش PCR برای ژن tk که باند bp ۱۱۰۰ مربوطه را دارد.
▪ کنترل منفی مربوط به ژن tk.
بعد از انجام PCR (Polymeras Chain Reaction) با استفاده پرایمرهای اختصاصی هر یک از ژنهای تیمیدین کیناز، آلفاتوبولین و سیتوزین دآمیناز، حضور هر یک از این قطعات در پلاسمید مذکور تایید گردید (تصویر شماره ۳) و ترتیب صحیح قرار گیری آنها نیز ضمن هضم برشی با آنزیم های محدودالاثر اثبات شد و کانستراکت نهایی pF۴X۱.۴sat (tk-&#۹۴۵;tub-cd) بدست آمد.
● بحث:
این مطالعه وارد سازی ژنهای سیتوزین دآمیناز مخمر ساکارومایسس سرویزیه و تیمیدین کیناز ویروس هرپس سیمپلکس تیپ ۱ را به یک وکتور یوکاریوتی شرح می دهد. این طرح اساس پیشرفت سیستم های انتخاب منفی و یا وکتورهای خودکشی سلولی برای دستکاری ژنتیکی انگل لیشمانیا را تشریح می¬کند. پلاسمید نوترکیب حاصل از این تحقیق، در مقایسه با دیگر پلاسمیدهای بکار رفته در این زمینه دارای مزایای زیادی از جمله توانایی وارد ساختن ژنهای خارجی حمل شده به درون ژنوم لیشمانیا و از طرفی وارد ساختن این ژنها به صورت هدفمند در مکان دلخواه، یعنی در محل ژن زیر واحد کوچک ریبوزوم و مزیت دیگر آن اینکه نه تنها ژنهای حمل شده را وارد مکان خاصی از ژنوم می کند بلکه با توجه به اینکه تعداد نسخه های فراوانی از ژن زیر واحد کوچک ریبوزوم در هر سلول وجود دارد، پس تعداد زیادی از ژنهای خارجی وارد ژنوم لیشمانیا می نماید و محصولات زیادتری تولید خواهد کرد. برای اولین بار در سال ۱۹۹۰، ژن HSV-tk را در پلاسمیدی کلون کرده و وارد سلول لیشمانیا نمودند. در این روش پلاسمید حامل این ژن به صورت اپی زومال قرار داشت و ژن tk قادر به درج شدن در ژنوم لیشمانیا نبود. در واقع این اولین باری بود که از ژن tk به عنوان یک مارکر انتخابی منفی استفاده می گردید . در سال ۱۹۹۸ از انگل لیشمانیای حامل ژن tk در ایجاد واکسیناسیون علیه لیشمانیا بهره گرفته شد و درمان زخم ناشی از انگل با داروی گانسیکلوویر موفقیت آمیز بود . ژن سیتوزین دآمیناز در سال ۱۹۹۲ توسط PCR از باکتری E. coli بدست آمد و به دنبال آن از مخمر جدا شد و در وکتوهای مختلف کلون گردید . ژن cd در سال ۱۹۹۸ به عنوان یک مارکر انتخابی منفی در Toxoplasma gongii به کار رفت و این انگل به داروی۵- فلوروسیتوزین حساس شد و این در حالی است که انگل وحشی به طور طبیعی نسبت به داروی ۵- فلوروسیتوزین حساس نمی باشد . در این تحقیق علاوه بر کلون سازی ژنهای تیمیدین کیناز و سیتوزین دآمیناز، ژن آلفاتوبولین لیشمانیا نیز در کنار آنها کلون گردید. برای بیان شدن ژنهای بیگانه در ژنوم لیشمانیا نیاز به ژنهای خودی است که بهترین آنها ژن آلفاتوبولین می باشد. این ژن به صورت چندین کپی و به صورت تکرارهای پشت سر هم (Tandem repeat) در ژنوم لیشمانیا وجود دارد و به میزان بسیار بالایی در سلول لیشمانیا بیان می گردد. ژن آلفاتوبولین روی میزان بیان ژنهای فرادست و فرودست خود اثر افزایشی دارد . استفاده از دو ژن خودکشی سلولی در یک وکتور از این مزیت برخوردار است که چنانچه سلول حساسیت خود را نسبت به یکی از دست داد، نسبت به دیگری همچنان حساسیت خواهد داشت . با انتقال کاست ژنی ساخته شده در این تحقیق، به درون ژنوم لیشمانیا می توان سوش نوترکیب مناسب بدست آورد که قابلیت کنترل عفونت زایی بواسطه آن آسان است و در آینده می توان از آن در تحقیقات تولید واکسن زنده علیه لیشمانیا استفاده کرد.
● نتیجه گیری:
سیستم طراحی شده در این تحقیق می تواند دو ژن خودکشی سلولی را به درون ژنوم لیشمانیا منتقل کند و در تحقیقات آینده در زمینه دستیابی به واکسن زنده علیه لیشمانیا مورد استفاده قرار گیرد.

عباس دوستی، دکتر نوشین داودی، دکتر فریدون مهبودی دانشجوی دکتری تخصصی ژنتیک مولکولی- مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی – دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، استادیار مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی- انستیتو پاستور ایران، دانشیار مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی – انستیتو پاستور ایران
منابع:
۱.Khan MA, Maruno M, Khaskhely NM, Ramzi ST, Hosokawa A, Uezato H, et al. Inhibition of intracellular proliferation of Leishmania parasites in vitro and suppression of skin lesion development in balb/c mice by a novel lipid a analog (ONO-۴۰۰۷). Am J Trop Med Hyg. ۲۰۰۲ Aug; ۶۷(۲): ۱۸۴-۹۰.۲.Ashford RW, Desjeux P, Deraadt P. Estimation of population at risk of infection and number of cases of Leishmaniasis. Parasitol Today. ۱۹۹۲ Mar; ۸(۳): ۱۰۴-۵.
۳.Norsworthy NB, Sun J, Elnaiem D, Lanzaro G, Soong L. Sand fly saliva enhances Leishmania amazonensis infection by modulating interleukin-۱۰ production. Infect Immun. ۲۰۰۴ Mar; ۷۲(۳): ۱۲۴۰-۷.
۴.Handman E. Leishmaniasis: current status of vaccine development. Clin Microbiol Rev. ۲۰۰۱ Apr; ۱۴(۲): ۲۲۹-۴۳.۵.Yazawa K, Fisher WE, Brunicardi FC. Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J Surg. ۲۰۰۲ Jul; ۲۶(۷): ۷۸۳-۹.۶.Martin LA, Lemoine NR. Direct cell killing by suicide genes. Cancer Metastasis Rev. ۱۹۹۶ Sep; ۱۵(۳): ۳۰۱-۱۶.۷.LeBowitz JH, Cruz A, Beverley SM. Thymidine kinase as a negative selectable marker in Leishmania major. Mol Biochem Parasitol. ۱۹۹۲ Apr; ۵۱(۲): ۳۲۱-۵.
۸.Muyombwe A, Olivier M, Ouellette M, Papadopoulou B. Selective killing of Leishmania amastigotes expressing a thymidine kinase suicide gene. Exp Parasitol. ۱۹۹۷ Jan; ۸۵(۱): ۳۵-۴۲.۹.Khamesipour A, Rafati S, Davoudi N, Maboudi F, Modabber F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian J Med Res. ۲۰۰۶ Mar; ۱۲۳(۳): ۴۲۳-۳۸.۱۰.Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. ۳rd ed. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Pres; ۱۹۸۹. p: ۱۷-۲۲.
۱۱.Fox BA, Belperron AA, Bzik DJ. Stable transformation of Toxoplasma gondii based on a pyrimethamine resistant trifunctional dihydrofolate reductase-cytosine deaminase-thymidylate synthase gene that confers sensitivity to ۵-fluorocytosine. Mol Biochem Parasitol. ۱۹۹۹ Jan; ۹۸(۱): ۹۳-۱۰۳.۱۲.Danielsen S, Kilstrup M, Barilla K, Jochimsen B, Neuhard J. Characterization of the Escherichia coli. codBA operon encoding cytosine permease and cytosine deaminase. Mol Microbiol. ۱۹۹۲ May; ۶(۱۰): ۱۳۳۵-۴۴.
۱۳.Curotto de Lafaille MA, Laban A, Wirth DF. Gene expression in Leishmania: analysis of essential ۵&#۰۳۹; DNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA. ۱۹۹۲ Apr; ۸۹(۷): ۲۷۰۳-۷.
۱۴.Spithill TW, Samaras N. Genomic organization, chromosomal location and transcription of dispersed and repeated tubulin genes in Leishmania major. Mol Biochem Parasitol. ۱۹۸۷ May; ۲۴(۱): ۲۳-۳۷.
۱۵.Borrelli E, Heyman R, Hsi M, Evans RM. Targeting of an inducible toxic phenotype in animal cells. Proc Natl Acad Sci USA. ۱۹۸۸ Oct; ۸۵(۲۰): ۷۵۷۲-۶.

منبع : مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی شهر کرد