ایمنی سنجی به چند روش

● روش‌های مختلف سنجش ایمنی و بررسی مزایا و معایب آنها
مقوله روش‌های مختلف سنجش مواد یكی از مهم‌ترین شاخه‌های تحقیقاتی به‌شمار می‌آید كه گاه نقاط عطفی در این میان پدید می‌آمده و روش جدیدی مطرح می‌گردد و تا رسیدن به روشی تازه، تحقیقات در جهت اصلاح و بهبود روش قبلی ادامه می‌یابد. بدیهی است كه هر روش معایب و محاسن خود را داشته و با توجه به این ویژگی‌ها گسترش یافته یا محدود می‌شود. گاهی نیز روش‌های جدید جایگزین روش‌های قبلی نیست، بلكه به موازات آنها از محدودیت‌های موجود می‌كاهند.
تا نیمه اول قرن بیستم به كمك روش‌های اندازه‌گیری دستگاهی (Instrumental Analysis)، سنجش‌های دقیق و حساسی جهت اندازه‌گیری آنالیت‌ها (Analytes) به‌كار می‌رفت. از آنجایی كه خواص فیزیكوشیمیایی مورد استفاده در تشخیص و اندازه‌گیری آنالیت‌ها اغلب از ویژگی لازم برخوردار نبودند، لذا از ادغام دو روش جداسازی و اندازه‌گیری، روش‌های جدیدی ایجاد شد. مثلاً روش رنگ‌سنجی (Colorimetery) ساده می‌توانست به دلیل جذب نوری تركیبات مشابه آنالیت، پاسخ‌های مثبت كاذب به وجود آورد اما روش قدرتمندی مانند كروماتوگرافی با كارایی بالا ابتدا تركیبات مشابه را از هم جدا كرده، سپس به سنجش هر كدام می‌پردازد.
امروزه انواع روش‌های دستگاهی جهت سنجش‌های ویژه و حساس آنالیت‌ها طراحی و در دسترس محققان قرار گرفته‌ است.
با پیشرفت جوانب مولكولی علوم مختلف، نیازی به اندازه‌گیری روزانه بسیاری از آنالیت‌ها احساس می‌شد، اما روش‌های دستگاهی مذكور برای این امر محدودیت‌هایی داشتند. از جمله این محدودیت‌ها می‌توان به
هزینه بالای خرید دستگاه مذكور، هزینه بالای مواد مصرفی و نگهداری دستگاه، نیاز به تخصص كافی كاربر، زمان طولانی سنجش و محدودیت تعداد اندازه‌گیری روزانه اشاره كرد.
در ابتدای نیمه دوم قرن بیستم، محصول سیستم ایمنی هومورال یعنی آنتی‌بادی‌ها یكی از نقاط عطف مورد بحث را به وجود آورد. آنتی‌بادی‌ها با اتصال ویژه به آنالیتی كه بر ضد آن تهیه شده ‌است به عنوان ابزاری مناسب برای سنجش‌های ویژه و سریع در اختیار محققان قرار گرفت. روش‌هایی كه از آنتی‌بادی‌ها به عنوان فاكتور شناساگر بهره می‌گیرد، روش‌های سنجش ایمنی نام دارد. ابداع این روش به سال ۱۹۵۹ برمی‌گردد.
«Yalow» و «Berson» محققانی بودند كه با استفاده از آنتی‌ژن نشان‌دار (رادیواكتیو) و آنتی‌بادی ویژه، هورمون انسولین را برای اولین بار مورد اندازه‌گیری قرار دادند. آنها كه در سنجش خود از محصول سیستم ایمنی و رادیواكتیویته استفاده كرده بودند، روش مذكور را سنجش ایمنی رادیواكتیو نام نهادند.
● اساس روش‌های سنجش ایمنی
شناسایی آنالیت، اولین مرحله در این نوع سنجش محسوب می‌شود. این عمل توسط آنتی‌بادی‌ انجام می‌پذیرد. به عبارتی، جزء لاینفك هر سنجش ایمنی واكنش میان آنتی‌ژن و آنتی‌بادی است.
در برخی موارد در محدوده معینی از غلظت آنتی‌ژن و آنتی‌بادی انجام واكنش منجر به تشكیل رسوب قابل رؤیت (قبل یا بعد از رنگ‌آمیزی) می‌گردد. اما در اغلب موارد، قبل و بعد از انجام واكنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی تغییر قابل مشاهده‌ای وجود ندارد، به همین دلیل وجود سیستم نشانه‌گذاری ضروری به نظر می‌رسید. همان‌طور كه اشاره شد در اولین سنجش كمی ایمنی، محققان از مواد رادیواكتیو برای نشاندار سازی استفاده نمودند.
جالب است بدانید یك نوع طبقه‌بندی سنجش‌های ایمنی بر اساس نام نوع نشاندارسازی سنجش بنا شده است. به عنوان نمونه، سنجش‌های ایمنی رادیواكتیو، سنجش‌های ایمنی آنزیمی، سنجش‌های ایمنی فلوئورسانس و ... به دلیل قدمت سنجش‌های ایمنی رادیواكتیو ابتدا به شرح مختصر این روش، خصوصیات و معایب آن خواهیم پرداخت.
● سنجش‌های ایمنی رادیواكتیو
در واكنش میان آنتی‌ژن و آنتی‌بادی هر كدام از این دو جزء را می‌توان با ماده رادیواكتیو نشاندار ساختو از لحاظ ردیابی كمپلكس ایجاد شده، تفاوتی میان جایگاه اتصال ماده رادیواكتیو وجود ندارد هر چند كه با همین تغییر ایگاه نشاندارسازی برخی از پارامترهای متدولوژیك دچار تغییر خواهند شد. چنانچه آنتی‌ژن با ماده رادیواكتیو نشاندار شود، سنجش را RIA (Radio Immuno Assy) می‌نامند.
اساس روش RIA رقابت میان آنتی‌ژن نشاندار و آنتی ژن موجود در نمونه مورد سنجش بر سر اتصال به آنتی‌بادی است. از آنجایی كه هر قدر میزان آنتی‌ژن موجود در نمونه سنجش بیشتر باشد، آنتی‌ژن رادیواكتیودار كمتری به آنتی بادی متصل می‌شود، میزان كمپلكس رادیواكتیو با آنتی‌ژن غیر رادیواكتیو رابطه معكوس دارد.
از آنجایی كه تماس ماده رادیواكتیو با سطح پوست بدن گرما و سوزش ایجاد می‌كند، لذا برخی محققان آنتی‌ژن رادیواكتیودار را آنتی‌ژن گرم و آنتی‌ژن غیررادیواكتیو را آنتی‌ژن سرد نامیده، اساس RIA را رقابت بین آنتی‌ژن سرد و گرم می‌دانند.
این روش سه جزء اصلی دارد: آنتی‌بادی، آنتی‌ژن سرد و آنتی ژن گرم.
با توجه به اینكه آنتی‌بادی بر علیه شاخص‌های مختلف آنتی‌ژن، تولید خواهد شد آنتی‌بادی مذكور را كه محصول كلون‌های مختلف سلولی است، آنتی‌بادی پلی كلونال می‌گویند. با پیشرفت تكنیك‌ هیبریدوما امروزه آنتی‌بادی‌های منوكلونال ویژه‌ای برای سنجش انواع آنالیت‌ها در دسترس است. لازم به یادآوری است كه به اشتباه برخی افراد آنتی‌بادی منوكلونال را ویژه‌تر از آنتی‌بادی پلی كلونال می‌دانند در حالی كه الزاماً رابطه مستقیمی میان ویژگی و نوع آنتی‌بادی وجود ندارد. یعنی آنتی‌بادی منوكلونال می‌تواند ویژگی برابر، كمتر و یا بیشتر از آنتی‌بادی پلی كلونال داشته باشد، هر چند در اغلب سنجش‌ها ما از آنتی‌بادی‌های منوكلونال ویژه استفاده می‌شود.
اما لفظ منوكلونال فقط گویای این مطلب است كه آنتی‌بادی مذكور از یك كلون سلولی ترشح شده است. چنانچه كلون مذكور برعلیه شاخص آنتی‌ژنی ویژه‌ای تشكیل شده باشد، آنتی‌بادی مذكور نیز ویژه خواهد بود. در مورد آنتی‌ژن گرم همواره دو حالت وجود دارد:
در حالت اول اتم رادیواكتیو به صورت طبیعی در ساختمان آنتی‌ژن وجود دارد با این تفاوت كه اتم مذكور در آنتی‌ژن سرد رادیواكتیو نیست ولی در آنتی‌ژن گرم ایزوتوپ رادیواكتیو آن به‌كار رفته است. مثلاً هورمون تیروكسین یا T۴ در ساختمان خود دارای چهار اتم ید است.
در سیستم RIA آنتی‌ژن گرم برای مثال بالا همان مولكول T۴ است، با این تفاوت كه به جای ید طبیعی از ایزوتوپ رادیواكتیو آن یعنی ید ۱۲۵ استفاده شده است. در حالت دوم اتم رادیواكتیو در ساختمان آنتی‌ژن طبیعی یا آنتی‌ژن سرد وجود ندارد. مثلاً در سنجش RIA هورمون انسولین، طی یك واكنش شیمیایی ید ۱۲۵ را روی حلقه‌های تیروزین ساختمان انسولین جای می‌دهند؛ لذا حلقهٔ تیروزین در ساختمان آنتی‌ژن سرد فاقد اتم ید است در حالی كه در آنتی‌ژن گرم دارای اتم ید رادیواكتیو است در حالت اول از لحاظ ساختمان شیمیایی تفاوتی میان آنتی‌ژن سرد و گرم وجود ندارد اما در حالت دوم باید مراقب بود تا افزایش ماده رادیواكتیو شاخص آنتی‌ژنی آنالیت را تحت تأثیر قرار ندهد، زیرا این امر می‌تواند واكنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی را كه اساس روش سنجش است، متأثر سازد.
به طور كلی در روش RIA، آنتی‌ژن سرد و آنتی‌ژن گرم بر سر اتصال به مقدار معین و محدودی از آنتی‌بادی با هم رقابت می‌كند. با توجه به اینكه اساس این روش رقابت است و رقابت در محدودیت معنا می‌یابد، لذا به این روش، معرف محدود (Restricted Reagent) نیز می‌گوید. در این روش ابتدا رقابت میان مقادیر متفاوت و معینی (استاندارد) از آنتی‌ژن سرد با مقدار معین و ثابتی از آنتی‌ژن گرم بر سر اتصال مقدار معین و محدودی از آنتی‌بادی ایجاد می‌شود كه ماحصل آن به دست آمدن منحنی استاندارد است.
با توجه به رابطهٔ معكوس میان كمپلكس‌ رادیواكتیو و میزان آنتی‌ژن سرد، همواره منحنی‌های استاندارد شكلی نزولی دارد. در منحنی استاندارد همیشه محور xها نشان‌دهندهٔ غلظت آنتی‌ژن سرد و محور y ها نشان‌دهنده میزان كمپلكس رادیواكتیو بر حسب CPM (Count per Minute) است. همان‌طور كه می‌دانید رادیواكتیویته و ناپایداری هسته برخی از ایزوتوپ‌های اتمی یك پارامتر ثابت فیزیكی است و همانگونه كه در اساس روش RIA ذكر شد میزان آنتی‌ژن گرم، همواره ثابت و معین است.
بنابراین میزان رادیواكتیویته تمام غلظت‌های استاندارد با هم برابر بوده، همواره منحنی استاندارد به صورت خطی موازی محور xها خواهد بود. یعنی به‌‌رغم اینكه میان كمپلكس رادیواكتیو در هر غلظت استاندارد متفاوت است اما میزان رادیواكتیویته كل هر نقطه استاندارد با سایر نقاط برابر است، لذا در این مرحله نیازبه جداسازی آنتی‌ژن گرم از كمپلكس رادیواكتیو وجود دارد. مرحله جداسازی با روش‌های متفاوتی امكان‌پذیر است ذكر جزئیات آن از حوصله این مقاله خارج است.
بعضی از این روش‌ها عبارتند از: استفاده از آنتی‌بادی دوم، استفاده از محلول‌های پلیمری مانند PEG، استفاده از تثبیت آنتی‌بادی‌ها، استفاده از ذرات مغناطیس و ...
پس از مرحله جداسازی رابطه معكوس بین غلظت آنتی‌ژن سرد و كمپلكس رادیواكتیو می‌تواند مبنای سنجش آنتی‌ژن موجود در نمونه مورد بررسی باشد. یعنی می‌توان از میزان كمپلكس رادیواكتیوی كه در مجاورت آنتی‌ژن سرد مجهول تشكیل می‌گردد با استفاده از منحنی استاندارد به میزان آنتی‌ژن سرد پی برد.
در هر حال، امروزه اغلب روش‌های IRMA به صورت غیررقابتی و ساندویچی اجرا می‌گردند. یعنی آنالیت توسط دو آنتی‌بادی ساندویچ می‌گردد كه یكی از این آنتی‌بادی‌ها توسط ماده رادیواكتیو نشاندار شده است. در این روش به ازای هر آنالیت یك ساندویچ نشاندار تشكیل می‌گردد، لذا رابطه مستقیم میان آنالیت و كمپلكس رادیواكتیو برقرار است.
در عمل، ابتدا به ازای مقادیر معین آنالیت (استانداردها) كمپلكس‌های رادیواكتیو تشكیل می‌گردد. غلظت آنالیت‌ روی محور x ها و میزان كمپلكس رادیواكتیو (CPM) روی محور yها قرار گرفته و بدین ترتیب منحنی صعودی كه نشانه رابطه مستقیم غلظت آنالیت با كمپلكس رادیواكتیو است، تشكیل می‌گردد.بر اساس میزان كمپلكس رادیواكتیو در نمونه‌های مجهول و استفاده از منحنی‌ فوق، غلظت آنالیت مجهول محاسبه می‌گردد.
● مزایای روش RIA به IRMA
۱) در روش RIA مولكول‌های آنتی‌ژن اغلب از جنس هاپتن (مولكول‌هایی با جرم مولكولی كمتر از ۱۰۰۰ دالتون) است. مانند انواع هورمون‌های استروئیدی، داروها، هورمون‌های تیروئیدی و ... محدودیت گروه‌های عامل (Functional Group) در مولكول‌های مورد نظر، نشاندارسازی را محدود ساخته، اغلب نیاز به واكنش‌های تخصصی و پیچیده دارد، اما در روش IRMA همیشه نشاندارسازی روی مولكول پروتئین بزرگ آنتی‌بادی انجام می‌گیرد. این مولكول‌ بزرگ دارای انواع گروه‌های عملكردی است كه به‌راحتی با روش‌های ساده و عمومی می‌توان آنها را نشاندار ساخت،
۲) یكی از پارامترهای متودولوژیك، ویژگی (Specificity) است. در روش RIA با استفاده از یك آنتی‌بادی، شناسایی منفرد (Single recognition) صورت می‌گیرد، در حالی كه در روش IRMA استفاده از دو آنتی‌بادی منوكلونال ویژه، ویژگی را افزایش می‌دهد،
۳) حساسیت همواره یكی از مشخصات مهمی است كه در طراحی روش‌های مدنظر محققان قرار می‌گیرد. در روش RIA اساس، رقابت بوده در یك محدوده معین از غلظت رابطه‌ای میان نسبت رقابت و كملپكس رادیواكتیو وجود دارد، لذا حساسیت IRMA به دلیل وجود رابطه یك به یك میان آنالیت و كمپلكس رایدواكتیو از RIA بیشتر است. در روش IRMA جایگاه‌های نشاندار‌سازی بالقوه از روش RIA بیشتر است، لذا تعداد سیگنال‌های دریافتی یا به عبارتی حساسیت بالاتر می‌رود. در پیشرفت دستگاهی، چنانچه دستگاه حساس‌تری طراحی شود به طوری كه به CPM‌های پایین حساسیت بیشتری داشته باشد، در روش RIA به خوانش غلظت‌های پایین یاری می‌رساند و می‌دانید كه حساسیت با غلظت‌های پایین مرتبط است،۴) واكنش آنتی ژن و آنتی‌بادی یك واكنش تعادلی غیركووالانی بوده، اندازه‌گیری در نقطه تعادل، دقیق و تكرارپذیر است. لذا در كلیه روش‌های سنجش ایمنی زمانی به‌نام زمان انكوباسیون مطرح است. در واقع این زمان برای به تعادل رسیدن واكنش در نظر گرفته شده است. در روش IRMA به دلیل اینكه اغلب رقابت وجود ندارد، برای حصول اطمینان از كفایت آنتی‌بادی‌ها برای تشكیل كمپلكس غلظت‌های بالای آنالیت، همواره مقدار زیادی از آنتی‌بادی‌ها به كار می‌رود،
در روش IRMA به دلیل معرف مازاد، طبق اصل لوشاتلیه تعادل به سمت تشكیل كمپلكس جابه‌جا می‌شود. لذا غلظت بالای مواد اولیه سرعت به تعادل رسیدن یا زمان انكوباسیون را كاهش می‌دهد. بنابراین یكی دیگر از مزایای روش IRMA نسبت به RIA كاهش زمان انكوباسیون است،
۵) محدوده قابل اندازه‌گیری آنالیت را محدوده عملكرد روش می‌گویند. این محدوده فاصله بین اولین و آخرین نقطه استاندارد است. در روش RIA مبنا رقابت است و همیشه در محدوده معینی از غلظت‌ها رقابت معنا دارد، ولی در IRMA به ازای هر آنالیت یك كمپلكس سیگنال‌دهنده تشكیل می‌شود، لذا محدوده عملكرد در IRMA حدود ۱۰۰ برابر بیشتر از RIA است،
۶) در روش RIA كلیه مراحل نمونه‌برداری از نمونه، استاندارد، كنترل و محلول نشاندار دارای اهمیت بوده، در دقت كل روش سهیم است. روش IRMA همان‌طور كه ذكر شده یك روش معرف مازاد است و مرحله افزودن آنتی‌بادی كونژوگه تأثیر كمتری نسبت به همین مرحله در RIA دارد. لذا در كل، دقت مرحله نمونه‌برداری در IRMA وابستگی كمتری نسبت به RIA دارد و این یكی دیگر از مزایای IRMA محسوب می‌شود و
۷) مقاومت روش در برابر شرایط آزمایش یكی دیگر از پارامترهای روش‌شناسی است. در IRMA بیشتر از RIA از آنتی‌بادی مونوكلونال استفاده می‌شود. در مورد آنتی‌بادی مونوكلونال می‌توان شرایط محیطی از لحاظ PH، قدرت یونی و ... را طوری تنظیم كرد كه شرایط ایده‌آل تأمین شود اما در آنتی‌بادی‌های پلی كلونال انتخاب شرایط خاص برای گروهی از آنتی‌بادی‌ها مطلوب و برای برخی دیگر غیرمطلوب است. لذا این شرایط برای گروهی از آنتی‌بادی‌ها به مرور زمان مضر بوده، در حقیقت مقاومت روش IRMA نسبت به RIA در برابر شرایط آزمایش بیشتر است.
▪ در ادامه به برخی از محدودیت‌ها و معایب روش‌های سنجش ایمنی رادیواكتیو اشاره‌ می‌شود:
۱) خطر تشعشع، و خطر تشعشع هر چند ناچیز،
۲) نیاز به امكانات حفاظتی در برابر پرتوها،
۳) تولید زباله‌های رادیواكتیو،
۴) محدود بودن زمان انقضاء‌ كیت‌ها به دلیل نیمه‌عمر كوتاه
۵) محدودیت اتوماسیون
● اساس روش سنجش‌های ایمنی آنزیمی
اساس این روش‌ها مانند سنجش‌های ایمنی رادیواكتیو همان واكنش آنتی‌ژن- آنتی‌بادی است، با این تفاوت كه جهت ردیابی واكنش مذكور به جای رادیواكتیویته از آنزیم‌ها و واكنش‌های آنزیمی استفاده می‌شود.
در این روش نیز می‌توان جهت ردیابی واكنش، آنتی‌ژن و یا آنتی‌بادی را با آنزیم نشاندار ساخت. به عمل نشاندارسازی، كونژوگاسیون و به مولكول آنزیم‌دار، كونژوگه آنزیمی می‌گویند. چنانچه آنتی‌ژن كونژوگه گردد روش EIA (Enzyme Immuno Assay) گویند و اگر آنتی بادی كونژوگه گردد روش را IEMA (Immuno Enzymo Meteric Assay) نامیده می‌شود.
اساس روش EIA، رقابت میان آنتی‌ژن كونژوگه و آنتی‌ژن آزاد در نمونهٔ مورد سنجش بر سر اتصال به آنتی‌بادی است. در اینجا نیز میزان كمپلكس آنزیم‌دار با آنتی‌ژن آزاد رابطه معكوس دارد. لذا می‌توان بسته به نیاز از آنتی‌بادی‌های پلی كلونال یا مونوكلونال استفاده كرد.
البته در برخی سنجش‌ها آنتی‌بادی‌های الیگو كلونال پاسخ بهتری ایجاد می‌كند. (چنانچه چند نوع آنتی‌بادی مونوكلونال را با هم مخلوط كنیم، مجموعه حاصله را آنتی‌بادی الیگوكلونال می‌نامند).
یكی از تفاوت‌های RIA با EIA در این است كه اغلب، آنالیت رادیواكتیودار از لحاظ ساختمان شیمیایی و ابعاد فیزیكی با آنالیت سرد یكسان بوده یا تفاوت ناچیزی دارد اما در EIA آنالیت كونژوگه به آنزیم (كه اغلب مولكول‌های پروتئینی بزرگی است) متفاوت است، لذا نوع آنتی‌بادی به‌كار رفته و شرایط سنجش خصوصاً زمان انكوباسیون به‌گونه‌ای طراحی می‌شود كه این تفاوت ساختمان و ابعاد بر واكنش آنتی‌ژن- آنتی‌بادی اثر سوء به جای نگذارد.
▪ انواع روش‌های ایمنی آنزیمی عبارتند از:
۱) EIA رقابتی برای آنتی‌ژن:
در این روش آنتی‌ژن كونژگه و آنتی‌ژن آزاد بر سر اتصال به آنتی‌بادی مشترك با یكدیگر رقابت می‌كند. پس از جداسازی كمپلكس آنزیم‌دار از كونژوگه ازاد، فعالیت آنزیمی مبنای سنجش قرار می‌گیرد. در اینجا نیز رابطه معكوس میان كمپلكس آنزیمی و آنالیت آزاد وجود دارد. ابتدا واكنش آنزیمی مربوط به كمپلكس آنزیمی در حضور مقادیر معینی از آنالیت آزاد (استانداردها) بررسی شده، محور xها نشان‌دهنده غلظت آنالیت آزاد و محور yها مؤید فعالیت كمپلكس آنزیم‌دار بر حسب جذب نوری (OD) است. منحنی استاندارد، نزولی رسم شده و بر اساس آن میزان آنالیت در نمونه‌های مجهول سنجیده می‌شود،
۲) IEMA برای آنتی‌ژن:
ابتدا آنتی‌ژن با مقادیر مازاد آنتی‌بادی نشاندار واكنش می‌دهد. سپس مقادیر مازاد آنتی‌ژن تثبیت شده به محیط افزوده می‌شود تا با مابقی آنتی‌بادی وارد واكنش شود با جداسازی آنتی‌ژن‌های تثبیت شده و سنجش فعالیت آنزیمی متصل به آنتی‌ژن محلول، می‌توان میزان آنتی‌ژن را مشخص كرد. در اینجا نیز سیستم رقابتی نبوده، میزان فعالیت آنزیمی مشاهده شده با میزان آنالیت آزاد رابطه مستقیم دارد.
۳) IEMA ساندویچی برای آنتی‌ژن:
در این روش آنتی‌ژن یا آنالیت مذكور باید حداقل دو شاخص آنتی‌ژنیك مجزا و دور از هم داشته باشد. آنتی‌ژن طی یك یا در مواردی طی دو مرحله توسط آنتی‌بادی اول و آنتی‌بادی كونژوگه دوم ساندویچ می‌شود. پس از جداسازی آنتی‌بادی كونژگه مازاد كه در واكنش شركت نكرده، فعالیت كمپلكس ساندویچی آنزیم را اندازه‌گیری می‌كند. در این واكنش نیز به ازای هر آنالیت یك ساندویچ آنزیم‌دار تشكیل شده،‌ رابطه مستقیم بین میزان آنالیت و فعالیت كمپلكس آنزیم‌دار وجود دارد،‌
۴) IEMA ساندویچی برای آنتی‌بادی:
در این روش آنتی‌بادی مورد سنجش بین آنتی‌ژن تثبیت شده و آنتی‌بادی دوم علیه آنتی‌بادی مورد سنجش ساندویچ می‌شود، آنتی‌بادی دوم با آنزیم نشاندار شده است. پس از انكوباسیون و شست‌وشو فعالیت ساندویچ آنزیم‌دار را با افزودن سوبسترهای مناسب آنزیم‌دار اندازه‌گیری می‌كنند و میزان فعالیت آنزیم با غلظت آنتی‌بادی مورد سنجش رابطه مستقیم دارد،
۵) الایزای هوموژن:
همان‌طور كه اشاره شد نیاز به اندازه‌گیری روزمره و تعداد بالای برخی درخواست‌ها، بحث اتوماسیون را مطرح نمود. یكی از شرایط كمك‌كننده برای اتوماسیون هوموژن بودن سیستم است، یعنی سیستم سنجش نیازی به مراحل جداسازی مانند سانتریفیوژ كردن ندارد و فعالیت آنزیم برخلاف رادیواتیویته می‌تواند در حالت آزاد و متصل متفاوت باشد، مثلاً اتصال آنتی‌ژن به آنتی بادی سبب فعالیت یا مهار فعالیت آنزیم متصل به كمپلكس گردد، لذا نیازی به مرحله جداسازی نیست .
۶) سایر روش‌های الایزا:
در سیستم‌های الایزا می‌توان آنتی‌بادی و آنزیم‌دار و آنتی‌بادی آزاد را در اتصاف به آنتی‌ژن به رقابت گذاشت یا آنتی‌بادی و آنتی‌ژن آنزیم‌دار را وارد واكنش نمود و سپس آنتی‌بادی تثبیت شده را جهت جمع‌آوری آنتی‌ژن آنزیم‌دار مازاد به محیط افزود و پس از جداسازی، فعالیت آنزیمی را در محلول یا در فاز تثبیت شده مورد سنجش قرار داد.
در حالت اول رابطه مستقیم و در حالت دوم رابطه معكوس است.
در سنجش‌های آنزیمی به‌طور عمده از آنزیم پراكسید از (HRP) و فسفاتاز قلیایی (ALP) استفاده می‌‌شود اما می‌توان از هر نوع آنزیمی كه فعالیت ویژه آن بالا باشد، به فرم خالص و ارزن قابل تهیه باشد، جایگاه‌های مناسب جهت كنژوگاسیون پایدار به آنتی‌ژن یا آنتی بادی را داشته باشد و اندازه‌گیری میزان فعالیت آنها در آزمایشگاه‌های معمولی میسر باشد، بهره گرفت. البته هیچ‌كدام از اجزاء واكنش آنزیمی ترجیحاً نباید سمی و خطرناك باشد.
كلیه مزایایی كه IRMA بر RIA دارد در مورد IEMA بر EIA نیز حاكم است، لذا از تكرار جزئیات آن خودداری می‌شود.
● مزایای IEMA نسبت به EIA:
سادگی نشاندار كردن، افزایش حساسیت، ویژگی بالاتر، سرعت بیشتر واكنش، محدوده وسیع‌تر از غلظت آنالیت و مقاومت بیشتر در برابر شرایط آزمایش.
▪ مزایای روش‌های سنجش ایمنی آنزیمی به روش‌های سنجش ایمنی رادیواكتیو
ـ عدم وجود خطر تشعشع
ـ قیمت ارزان‌تر دستگاه‌ها
ـ معرف‌های ارزان
ـ نیمه‌عمر طولانی كیت‌های آنزیمی،
ـ امكان اتوماسیون،
ـ سرعت خوانش بالا:
ـ امكان افزایش حساسیت روش.
سنجش‌های نشاندار آنزیمی علاوه بر امكان ردیابی، امكان تقویت نیز دارد یعنی واكنش آنزیمی‌،‌ هر آنالیت را به یك كمپلكس آنزیم‌دار و هر آنزیم را به میلیون‌ها تغییر در ماده اولیه یا محصول مرتبط می‌سازد.
از آنجایی كه آنزیم‌های متفاوت، واكنش آنزیمی متفاوت و قابل ردیابی ایجاد می‌كند در یك نمونه می‌توان با استفاده از دیا چند كونژوگه آنزیمی و پیگیری چند فعالیت آنزیمی، چند آنالیت را به طور همزمان مورد سنجش قرار داد. هر چند فراهم آوردن شرایط یكسان برای فعالیت مناسب چند نوع آنزیم كار پیچیده‌ای است اما امكان‌پذیر است و امكان سنجش همزمان سرعت آزمون‌ها و همچنین هزینه آنها را كاهش می‌دهد.
● محدودیت سنجش ایمنی آنزیمی
سنجش ایمنی آنزیمی دارای برخی محدودیت‌ها نیز هست:
۱) همان‌طور كه اشاره شد، فعالیت رادیواكتیو یك پارامتر ثابت فیزیكی است كه میزان آن تحت تأیید شرایط محیطی مانند نور، درجه حرارت، آلودگی و ... قرار نمی‌گیرد اما واكنش آنزیمی تحت تأثیر پارامترهای مختلف قرار می‌گیرد لذا ردیابی رادیواكتیو پایدارتر و آسان‌تر از اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی است،
۲) اجزاء مختلف موجود در نمونه می‌توانند واكنش آنزیمی را تحت تأثیر قرار دهد و
۳) سیستم‌های هوموژن آنزیمی در حال حاضر فاقد حساسیت كافی بوده، در ضمن كاربرد آنها عمدتاً به هاپتن‌ها محدود شده است.
وجود محدودیت‌های فوق نظر محققان را به استفاده از سایر نشانگرها معطوف نموده است.

دكتر مجتبی صلوتی، گروه میكروبیولوژی، دانشگاه آزاد زنجان
مهندس فرانك سقطچی، گروه رادیولوژی، دانشگاه علوم پزشكی زنجان
دكتر احمد بیطرفان رجبی، بخش پزشكی هسته‌ای بیمارستان قلب شهید رجایی
منابع:
۱- اصول علمی الایزا، دكتر محمودجواد رسایی
۲- آشنایی با مبانی تئوری الایزا، دكتر مهدی هدایتی
۳- ایمونولوژی رویت، ایوان رویت، مترجم: دكتر عطیه عبادی، سارا مظاهری
۴- هیتوشیمی در پاتولوژی، دكتر فرخ قوام

منبع : مجله مهندسی پزشکی و تجهیزات آزمایشگاهی